人食管癌细胞的应用

背景^[1-3]

人食管癌细胞是1973年建系，来自人食管中段鳞癌组织，小块法原代培养建系。BALB/c裸鼠移植成瘤。

人食管癌细胞使用说明：

1.细胞株的复苏

a.将冻存管在37℃水浴锅中迅速完全融化(保持冻存管的盖子在液面以上以防止污染)，并适当轻轻摇晃促融，切勿vortex。快速、完全融化可以提高细胞的复苏效果。

b.打开冻存管前时用70%酒精擦拭细胞冻存管外壁，注意某些记号笔不耐酒精，小心标注的记号被擦拭掉。

c.将完全融化的细胞直接离心，或者转移至无菌1.5ml或其它合适无菌离心管中，500g离心2-5min，吸除上清，注意不要吸走细胞沉淀，然后用新鲜完全培养液重悬后转移至培养器皿，混匀，置于CO2培养箱37℃培养。

d.第二天视贴壁或生长状态，更换培养液。

人食管癌细胞

2.人食管癌细胞的常规传代流程

a.将细胞培养液、PBS等放入37℃水浴锅内预热。

b.以10cm细胞培养皿为例。吸出原培养皿中的培养液，用2-5ml无菌PBS润洗细胞1-2次以去除残留的血清(如果细胞贴壁较差，润洗时要轻柔以避免细胞飘起)，然后加1-2ml胰酶细胞消化液(含EDTA)室温消化，注意消化时间，通常为1-5分钟。如果细胞比较难消化，可以置于37℃细胞培养箱一定时间以加速消化。注意：消化时间过长，会导致传代后细胞出现生长状态不良的情况。

c.每30秒-1分钟用显微镜观察细胞消化情况，贴壁细胞明显收缩、细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起，并用移液器吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液，再加入1-2ml新鲜完全培养液，适当晃动细胞皿以终止胰酶作用，用移液器轻轻吹打贴壁的细胞，获取细胞悬液。吹打时需控制力度，避免产生大量气泡，将细胞悬液分别接种到另外的2~5个细胞培养皿内，加入新鲜培养液，置于CO2培养箱37℃培养，第2天观察细胞贴壁生长情况。

d.也可以在消化后，加3-5ml完全培养液终止消化，用移液器轻轻吹打细胞悬液，尽量把细胞全部吹落、吹散，然后将全部细胞悬液500g离心2-5min，离心后去上清，再用完全培养液重悬后转移到新的培养皿中，添加适量完全培养液，于CO2培养箱37℃培养。

e.注意培养液的酚红颜色变化或根据细胞的换液要求定期换液，待细胞密度达到80-90%时需要传代或者冻存。如果没有及时传代导致细胞过密，传代后细胞容易出现生长状态不良的情况。

3.人食管癌细胞株的冻存

a.按照细胞传代方法收集细胞。

b.细胞计数：一般要求冻存的细胞，每毫升的细胞数量为1×106-107个细胞。

c.取适当细胞悬液，500g离心2-5min，弃上清，加入细胞冻存液，重悬，转移到冻存管中，用记号笔标记好细胞株名称、冻存日期、代数等信息，并记录在相应表格中以便管理和快速查找细胞位置。

d.将冻存管放入专用的细胞冻存盒中，-80℃过夜，然后转移至液氮灌中保存。如果没有专用的细胞冻存盒，可以按下面程序进行冻存：4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，然后转移至液氮灌中保存。冻存细胞储存在-80℃中通常不建议超过半年，时间太长会影响复苏效率。推荐使用碧云天的BeyoCool™细胞冻存盒(FCFC012)。

e.为保持细胞的良好状态，每隔1年，取出1-2支冻存的细胞复苏一次，并冻存新的细胞。

应用^[4][5]

人食管癌细胞可以用于小檗胺对人食管癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响及机制

以人食管癌细胞株Eca109和EC9706为研究对象,初步探讨小檗胺对人食管癌细胞株细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响及机制。

目的(1)研究小檗胺对人食管癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制;

(2) 为临床食管癌的治疗提供新的药物选择奠定实验基础。

方法：经不同浓度小檗胺处理体外培养的人食管癌细胞Eca109、EC9706细胞,采用MTT法检测细胞增殖的变化;采用Annexin V-PI染色法检测肿瘤细胞周期分布的变化;采用实时荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞凋亡相关基因mRNA的表达;采用Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白的表达。

结果：(1)小檗胺分别作用于Eca109细胞以及EC9706细胞24h、48h和72h的IC50值,随着作用的时间的增加,抑制率逐渐增加,IC50值逐渐降低(P<0.01)。

(3) 小檗胺(40μg/mL)处理Eca109细胞以及EC9706细胞48h后能够显著促进食管癌细胞的凋亡(P<0.01)。

(4) 小檗胺通过阻滞细胞周期在G0/G1期达到抑制细胞增殖的目的(P<0.05)。

(5) 小檗胺(40μg/mL)处理Eca1 09细胞以及EC9706细胞48h能够增强Caspase-3、Caspase-9以及Bax基因mRNA和蛋白的表达,同时降低Bcl-2的基因mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。

结论(1)小檗胺可抑制人食管癌Eca109及EC9706的细胞增殖,并使其细胞周期阻滞于G0/G1期。

(2)小檗胺诱导人食管癌细胞凋亡的机制可能与增强Caspase-3、Caspase-9以及Bax基因的表达,同时降低Bcl-2的基因表达有关。

参考文献

[1]Ameliorating effect of berbamine on hepatic key enzymes of carbohydrate metabolism in high-fat diet and streptozotocin induced type 2 diabetic rats[J].Chandrasekaran Sankaranarayanan;;Ramajayam Nishanthi;;Pachaiappan Pugalendi.Biomedicine&Pharmacotherapy,2018

[2]Global cancer statistics,2012[J].Lindsey A.Torre;;Freddie Bray;;Rebecca L.Siegel;;Jacques Ferlay;;Joannie Lortet‐Tieulent;;Ahmedin Jemal.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2015(2)

[3]A novel synthetic derivative of the natural product berbamine inhibits cell viability and induces apoptosis of human osteosarcoma cells,associated with activation of JNK/AP-1 signaling[J].Fan Yang;;Sangkil Nam;;Robin Zhao;;Yan Tian;;Lucy Liu;;David A Horne;;Richard Jove.Cancer Biology&Therapy,2013(11)

[4]Berbamine Inhibits the Growth of Liver Cancer Cells and Cancer-Initiating Cells by Targeting Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II[J].Zhipeng Meng;;Tao Li;;Xiaoxiao Ma;;Xiaoqiong Wang;;Carl Van Ness;;Yichao Gan;;Hong Zhou;;Jinfen Tang;;Guiyu Lou;;Yafan Wang;;Jun Wu;;Yun Yen;;Rongzhen Xu;;Wendong Huang.Molecular Cancer Therapeutics,2013(10)

[5]马亚飞.小檗胺对人食管癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响及机制[D].新乡医学院,2020.