人视网膜色素上皮细胞的应用

背景^[1-3]

人视网膜色素上皮细胞源自于一名19岁车祸罹难的健康男性的视网膜组织，由Amy Aotaki-Keen建系于1986年。该细胞系表达视网膜色素细胞特有的分子标记如胞内视黄醛结合蛋白和PRE-65。

视网膜色素上皮位于脉络膜和光感受器细胞外节之间，是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子、水、营养物质和代谢终产物转运通道。视网膜色素上皮参与视黄醇循环，吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性，并分泌多种生长因子，帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性。视网膜色素上皮细胞呈多角形，细胞分为三部分，即顶部、体部和基底部。

人视网膜色素上皮细胞

人视网膜是由位于眼睛后部多层结构组成的。它包括视细胞和视网膜色素上皮细胞（RPE），视网膜色素细胞通过提供营养和代谢废物来滋养视网膜。RPE位于神经视网膜和脉络膜之间，成为血视网膜屏障的外层控制着视网膜下间隙的化学成分，人们发现RPE在许多蛋白质的极性方面不同于其他上皮细胞。

几乎所有的上皮细胞的顶生面都没有基质，而RPE的顶生面胞膜是与细胞外基质相接触的。在早期胚胎发育过程中，RPE自发转分化为神经视网膜组织，RPE在其邻近的光感受器的发育和维持中有着重要的作用，光照条件下RPE能产生大量的活性氧，RPE的增殖也是许多眼病发病过程中重要的一步，如增殖性视网膜病变。

细胞特性

1)组织来源于人的正常眼组织。

2)细胞鉴定：细胞角蛋白-8(CK-8)免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5) 细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。

人视网膜色素上皮细胞培养方法：

1、细胞传代:细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次;

②加入2ml0.25%胰酶(T25瓶),使胰酶覆盖整个瓶或皿,盖好放入培养箱消化;

③1-2min后,显微镜下观察细胞,若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;若细胞还是贴壁,放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止;

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清;

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中,T25培养瓶加6-8ml培养基;

2、细胞复苏:

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化,时间1min左右,加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1-2ml培养基吹匀,将细胞悬液加入培养瓶中,补加适量培养基。

3、细胞冻存:待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清,用PBS或生理盐水清洗1-2次,加入1mL 0.25%胰蛋白酶(T25瓶)

②1-2min后,显微镜下观察细胞,大部分细胞回缩且有少量细胞脱落,轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化;

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min,弃上清,加1ml冻存液重悬细胞;

④将冻存管放入程序降温盒,放入-80℃冰箱,4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

应用^[4][5]

人视网膜色素上皮细胞可以用于慢病毒介导ERRα基因过表达在蓝光诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡中的作用研究

探讨慢病毒介导的ERRα基因(Estrogen-related nuclear receptorα,ERRα)过表达对蓝光诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡的保护作用,为防治视网膜光损伤类疾病以及深入理解年龄相关性黄斑变性发病机制甚至保护性靶标基因的探索提供理论依据。

方法:将过表达ERRα基因的重组慢病毒和空载体慢病毒转染处于对数生长期的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞株),使用嘌呤霉素筛选获得稳定表达ERRα基因的ARPE-19细胞作为实验组,感染空载体慢病毒的ARPE-19细胞作为对照组(NC组),待细胞生长至状态良好后采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-q PCR)和蛋白质印迹实验(Western blot)检测细胞中ERRαm RNA和蛋白的表达验证转染是否成功。

转染成功后将两组细胞置于无蓝光照射的培养箱中培养、和置于蓝光波长为460nm,光照强度为2000±500Lux的蓝光损伤模型再放于培养箱中6小时,后将两组继续避光孵育24小时,最后使用RT-q PCR检测各组凋亡相关标志物Caspase-3、Caspase-9、Bax和抗凋亡相关标志物Bcl-2 m RNA的表达,Western blot对各组凋亡相关标志物Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9、Bax和抗凋亡相关标志物Bcl-2蛋白的表达进行检测。

结果:(1)慢病毒转染ARPE-19细胞培养成功,空载体慢病毒转染组(NC组)ERRαm RNA表达量和蛋白表达量较少,ERRα过表达慢病毒转染组ERRαm RNA和蛋白表达量明显增多。

(2) 蓝光照射能使ARPE-19细胞形态发生改变,且不经过ERRα过表达处理的细胞异形更多。

(3) 蓝光能诱导细胞发生凋亡。

(4) ERRα过表达组和空载体组(NC组)经过蓝光光照6小时后,ERRα过表达组较NC组的凋亡相关标志物m RNA和蛋白表达量降低,抗凋亡相关标志物m RNA和蛋白的表达量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。

结论:慢病毒介导的ERRα基因过表达可以对抗由蓝光诱导的ARPE-19细胞凋亡,从而保护细胞,具体机制需进一步探究。ERRα的保护作用可能从分子水平上为年龄相关性黄斑变性或光损伤疾病治疗提供帮助。

参考文献

[1]The quest to treat dry age-related macular degeneration[J].Eisenstein Michael.Nature,2021(7887)

[2]Single-Cell RNA Sequencing of Retina:New Looks for Gene Marker and Old Diseases[J].Ying Peixi;Huang Chang;Wang Yan;Guo Xi;Cao Yuchen;Zhang Yuxi;Fu Sheng;Chen Lin;Yi Guoguo;Fu Min.Frontiers in Molecular Biosciences,2021

[3]Integrated analysis of multimodal single-cell data.[J].Hao Yuhan;Hao Stephanie;AndersenNissen Erica;Mauck William M;Zheng Shiwei;Butler Andrew;Lee Maddie J;Wilk Aaron J;Darby Charlotte;Zager Michael;Hoffman Paul;Stoeckius Marlon;Papalexi Efthymia;Mimitou Eleni P;Jain Jaison;Srivastava Avi;Stuart Tim;Fleming Lamar M;Yeung Bertrand;Rogers Angela J;McElrath Juliana M;Blish Catherine A;Gottardo Raphael;Smibert Peter;Satija Rahul.Cell,2021(13)

[4]Single‐Cell Sequencing Methodologies:From Transcriptome to Multi‐Dimensional Measurement[J].Chen Yingwen;Song Jia;Ruan Qingyu;Zeng Xi;Wu Lingling;Cai Linfeng;Wang Xuanqun;Yang Chaoyong.Small Methods,2021(6)

[5]安宁.慢病毒介导ERRα基因过表达在蓝光诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡中的作用研究[D].贵州医科大学,2022.