HCCC-9810的应用

背景^[1-3]

HCCC-9810源自一位女性肝胆管细胞癌患者。呈上皮细胞样，染色体模式数为71，但染色体数目可以在22-117的范围内变动。倍增时间为20.4小时。AFP，CEA和CA19-9的分泌水平低，在裸鼠中的成瘤率为20%。

HCCC-9810

HCCC-9810培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

HCCC-9810可以用于特异性MUC5AC-siRNA表达质粒的构建及其对胆管癌细胞株HCCC-9810增殖及凋亡的影响的研究

利用RNA干扰技术,针对MUC5AC基因的不同靶序列,构建了三个表达小发夹RNA得表达质粒,分别观察其在HCCC-9810中对MUC5AC基因的沉默作用,并研究抑制MUC5AC基因后对此肿瘤细胞生长及凋亡的影响,由此可以研究MUC5AC在MUC5AC相关肿瘤发生发展中的作用,并探讨其在MUC5AC相关肿瘤的基因治疗方面潜在的应用价值。

目的探讨MUC5AC特异性siRNA对人肝内胆管癌细胞珠HCCC-9810体外增殖及凋亡能力的影响。

方法设计合成三对特异性siRNA,构建了三个可在哺乳动物细胞中表达siRNA的表达质粒,pRNAT-U6.1/Neo-MUC5AC-siRNA1/2/3,应用脂质体转染技术分别将三个稳定表达的质粒和对照质粒(空质粒对照)转染HCCC-9810,同时此载体可独立表达DsRed荧光蛋白,转染后8至12小时在荧光显微镜下可通过直接观察荧光蛋白的表达来计算质粒的转染效率,而不影响siRNA沉默的效果,RT-PCR检测MUC5AC基因mRNA水平;SABC免疫组化染色技术检测MUC5AC粘蛋白的表达;MTT检测细胞生长增殖情况;流式细胞仪分析细胞凋亡。

结果基因测序表明成功构建质粒;转染后荧光蛋白表达率28.57%;RT-PCR结果表明在mRNA水平,三个质粒都可抑制MUC5AC基因的表达,并可使MUC5AC的表达下降,MTT结果对细胞的生长有一定的抑制作用,流式细胞仪分析结果使肿瘤细胞凋亡增加。

结论构建pRNAT-U6.1/Neo-MUC5AC-siRNA1/2/3质粒明显抑制了MUC5AC基因在mRNA水平及蛋白的表达,并可抑制肿瘤细胞的生长增殖和诱导其凋亡,为探讨MUC5AC在MUC5AC相关肿瘤的基因治疗方面奠定了一定的理论基础。

参考文献

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[3]ADAM8 expression is associated with increased invasiveness and reduced patient survival in pancreatic cancer[J].N.Valkovskaya;H.Kayed;K.Felix;D.Hartmann;N.A.Giese;S.P.Osinsky;H.Friess;J.Kleeff.Journal of Cellular and Molecular Medicine,2007(5)

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[5]任雪峰.特异性MUC5AC-siRNA表达质粒的构建及其对胆管癌细胞株HCCC-9810增殖及凋亡的影响的研究[D].安徽医科大学,2009.