高浓度Taq酶抗体的检测分析方法

制备^[1]

目前，常制备酶的多克隆抗体用于热启动，酶抗体与酶结合后抑制DNA聚合酶的活性。抗原抗体复合物用于扩增时，高温变性之前的步骤中抗Taq抗体与酶结合能抑制聚合酶活性，因此在低温条件下能有效抑制引物的非特异性退火和引物二聚体导致的非特异性扩增。高浓度Taq酶抗体在反应的变性步骤中变性，释放出聚合酶的活性，达到热启动的目的。

实验方法：

动物模型为小鼠C57/BL6

向小鼠体内注射抗原，并加强免疫，一段时间后取血测抗血清中抗体的量，待抗体产量不再明显上升时停止免疫取血得抗血清。所得的抗血清用硫酸按沉淀的方法简单纯化后即用于实验研究。抗体增量示意图如下：

酶与高浓度Taq酶抗体的孵育^[2]

抗原与抗体以合适的比例孵育结合才最有利于反应的进行。抗体量不足时，不足以抑制抗原化酶在常温下的活性；抗体量过多时，大量蛋白的存在又会严重影响反应的效率。方法为将得到的抗体用分别稀释2、4、8、16、32倍，将梯度稀释的抗体分别与抗原按1:1的比例混匀后置于37°孵育4-5h。

高浓度Taq酶抗体的检测分析方法

琼脂糖双向免疫扩散实验

实验原理

在一定的条件下（抗原与抗体的浓度比合适），当可溶性抗原（蛋白质、多糖、类月旨、血清、各种微生物培养液等）于相应的抗体在电解质存在的条件下相遇，经过一定时间出现人肉眼可见的沉淀现象，称为沉淀反应。此反应中的抗原称为沉淀原，相对应的抗体称为沉淀素。

一定浓度的琼脂糖凝胶其内部为多孔的网状结构，分子量为十几万到几百万以上的大分子物质可自由通过。抗原与抗体的分子量基本在万以上，在琼脂糖凝胶中能自由扩散。由于琼脂糖凝胶化学性能稳定、透明度较好等优点，因此通常所用的含电解质的扩散介质为琼脂糖凝胶。在琼脂糖凝胶中，比例适当的抗原与相对应的抗体相遇，会出现白色的沉淀线。

此方法测定时将加热溶化的琼脂糖绕至玻璃片或培养皿中，待琼脂凝固后，打孔，将抗原和抗体分别加入小孔后，放置一段时间。若抗原与抗体呈特异性结合且比例适当，在抗原与抗体孔的中间区域就会出现一条白色沉淀线；若抗原抗体不匹配，则不会有沉淀线的出现。双向琼脂扩散实验中，常用到的孔型有双孔型、三孔型、双排孔型和梅花孔型。

参考文献

[1] 高纯度聚合酶制备技术研究

[2]Sharkey DJ,Scalic ER,Christy KG Jr,et al.Antibodies as thermilabile swithes:high temperature triggering for the polymerase chain reaction[J].Nature Biotechnology,1994,12(5):506-509.