杠柳毒苷的制备和应用

背景及概述^[1][2]

香加皮是萝藦科植物杠柳的干燥根皮，近年来香加皮常用于治疗急、慢性充血性心力衰竭(CHF)。香加皮有毒，过量服用能产生不良反应，临床上也有致死报告。2000年版的《中华人民共和国药典》中香加皮的含量测定项下采用4-甲氧基水杨醛为HPLC法测定用对照品，但是到目前为止并无4-甲氧基水杨醛具有相关药理作用的报道。杠柳毒苷(periplocin)即杠柳苷G是香加皮中的一种强心苷成分，与香加皮的临床疗效密切相关，因此以杠柳毒苷作为香加皮治疗CHF的质控指标较为合理。

1969年日本学者从香加皮中分离出杠柳毒苷并确定了结构，采用的方法为甲醇或乙醇提取，提取液浓缩后用苯萃取，苯萃后的水层用水饱和的正丁醇萃取，正丁醇部位浓缩后反复经硅胶柱杠柳毒苷单体(产率0.02％)。1989年从杠柳的同属植物滇 杠柳(黑龙骨)也分离出杠柳毒苷，采用方法为95％乙醇回流提取，醇提取物经石油醚脱脂后，用丙酮回流提取，丙酮可溶部位经硅胶柱层析和RP-8硅胶反相柱层析，得到杠柳毒苷(产率0.023％)。到目前为止所采用的杠柳毒苷的制备方法，有的是对原料用95％乙醇回流提取，对药材的提取不完全，并且提取出的低极性杂质多，不利于杠柳毒苷单体的分离；有的要经反复硅胶柱层析，即费溶剂又费时间，产率低，成本较高。

制备^[1-2]

方法1：一种杠柳毒苷的制备方法，包括以下步骤：将杠柳茎或根在预定温度下烘干，并将烘干的杠柳茎或根粉碎以获得杠柳茎或根粉末；将预定重量的杠柳茎或根粉末放入容器中，并将预订量的乙醇溶液加入容器中搅拌混合，获得杠柳茎或根粉乙醇混合液；对杠柳茎或根粉乙醇混合液进行超声提取后，放冷至室温，并过滤及合并滤液浓缩至干后，得杠柳毒苷。

利用上述杠柳毒苷的制备方法提取杠柳毒苷时，将杠柳茎或根烘干并粉碎以获得杠柳茎或根粉末，然后向预定重量的杠柳茎或根粉末中加入预订量的乙醇混合均匀，再对杠柳茎或根粉乙醇混合液进行超声提取后，放冷至室温，并过滤及合并滤液浓缩至干后得杠柳毒苷，可见采用本方法提供的杠柳毒苷提取工艺，可简化提取流程，节省提取时间，扩大杠柳毒苷提取部位，降低提取成本，尤其是从茎中提取杠柳毒苷，不涉及杠柳根部，只要对杠柳地上部分采取平茬或刈割即可获得原料，这对保护杠柳资源，发挥杠柳防风治沙的生态效益意义重大。

方法2：一种杠柳毒苷的制备方法，包括以下步骤：

(1)香加皮药材的提取：500g香加皮加4000mL体积百分比浓度为40％乙醇溶液，回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至约500mL，加500mL水稀释后过滤，得澄清的香加皮水溶液；

(2)大孔树脂吸附分离：将香加皮水溶液用已经预处理好的AB-8大孔树脂吸附，用10％～95％乙醇梯度洗脱，收集各洗脱部位，减压蒸干溶剂，残渣加乙醇溶解，分别进行薄层层析，用氯仿∶甲醇∶水＝65∶30∶10的下层为展开剂，3，5-二硝基苯甲酸试剂显色，结果显示部位3～5(40％～60％乙醇洗脱部位)中有紫红色斑点，将其合并，得强心苷部位；

(3)硅胶柱层析分离：160～200目层析硅胶300克用乙酸乙酯湿法装柱，强心苷部位干法上样，用体积比为11∶1～6∶1的乙酸乙酯∶甲醇梯度洗脱，每200mL洗脱液为一份，各个流分分别减压蒸干溶剂加乙醇溶解后，进行薄层层析，用强心苷专用显色剂显色，收集合并含有 强心苷的流分，结果显示流分2～6中有强心苷成分；

(4)高效液相制备分离：将2～6流分用微孔滤膜(0.45μm)过滤后进行高效液相制备分离，色谱柱：C18反相色谱柱(Hypersil，5μm，10×250mm)；色谱条件：流动相为甲醇∶水＝30∶70；流速：2.5mL/min；同步采用紫外检测器于220nm监视流出曲线以指导产品收集，得到杠柳毒苷收集液。

(5)重结晶：将收集液减压浓缩，挥干溶剂，加2mL甲醇，转移至结晶皿中，放入干燥器 内(CaCl2干燥剂)，逐渐析出白色针状结晶，将结晶过滤出来，如此反复3次，干燥后共得结晶412mg，产率为0.08％。

应用^[3-4]

杠柳毒苷体外抑制肝癌细胞和乳腺癌细胞增殖的实验研究研究表明杠柳毒苷可明显抑制人肝癌 SMMC-7721 细胞的增殖，使细胞周期停滞在 G2/M 期，并能够诱导 SMMC-7721 细胞凋亡，杠柳毒苷还具有抑制食管鳞癌细胞 TE-1、TE-10、TE-13、 Eca-109 及乳腺癌 MCF-7 增殖的活性。MTT法观察杠柳毒苷对人乳腺癌MDA-MB-468细胞和人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用，流式细胞术观察杠柳毒苷对两种肿瘤细胞的细胞增殖周期作用。结果与对照组比较，杠柳毒苷能明显抑制两种肿瘤细胞的增殖，其抑制率与药物浓度和作用时间呈正相关。流式细胞仪检测发现，杠柳毒苷对乳腺癌MDA-MB-468细胞和肝癌HepG2细胞持续作用24 h后，可以使G0/G1期细胞增多，G2/M期细胞减少。结论杠柳毒苷具有抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞和肝癌HepG2细胞增殖的作用，并可将乳腺癌MDA-MB-468细胞和肝癌HepG2细胞的细胞生长周期阻滞在G0/G1期。 

此外，有研究观察杠柳毒苷对神经胶质瘤细胞增殖和凋亡的抑制作用。体外实验中，将不同质量浓度的杠柳毒苷作用于神经胶质瘤细胞，MTT法检测其对神经胶质瘤细胞增殖的抑制作用；DAPI荧光染色观察细胞核形态的变化；流式细胞术分析给药后神经胶质瘤细胞凋亡及细胞周期的变化情况；Western blot法检测给药后周期蛋白依赖激酶抑制剂P27的表达量。结果显示杠柳毒苷可以显著抑制神经胶质瘤细胞的生长增殖，且随着药物浓度的增加和作用时间的延长抑制作用也随之加强。因此不同浓度的杠柳毒苷可显著促进神经胶质瘤细胞的凋亡，在抑制细胞增殖的过程中，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P27的表达量显著升高。 

主要参考资料

[1] CN201210384263.8 杠柳毒苷的制备方法

[2] CN200410019967.0 杠柳毒苷的制备方法

[3] 杠柳毒苷对神经胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

[4] 杠柳毒苷体外抑制肝癌细胞和乳腺癌细胞增殖的实验研究