荧光素酶催化荧光素氧化发光

背景

你还记得次看到萤火虫的时候吗？萤火虫那种酷炫的黄色光线是由荧光素酶(luciferase)产生的。[1]萤火虫发光产生光线并非易事，需要消耗大量能量——一个绿光子所需的能量约等于分解八个ATP分子所耗费的能量。因此，荧光素酶使用了一种非常高能的过程来产生光。它有一个辅因子，被称为荧光素(luciferin)，它与氧形成高度紧张的复合物，使用ATP分子来辅助一切。当这个富氧荧光素在断裂的过程中形成二氧化碳，留下一个高度激发的形式，然后发出光线。[2]

图1 Firefly luciferase with the chromophore in yellow [2]

这种天然荧光素酶的发现激发了科学家们的兴趣，他们开始着手从萤火虫中提取和研究这种酶。随着研究的深入，科学家们发现荧光素酶具有很高的特异性和敏感性，可以被检测出非常微小的荧光素浓度。这种特性使得荧光素酶成为了生物技术领域中重要的标记物和检测工具，被广泛应用于药物筛选、细胞信号传导、蛋白质相互作用等领域。

此外，荧光素酶还可以与其他蛋白质或化合物结合形成复合物，从而发挥更加复杂的功能。例如，荧光素酶可以与一种名为“GFP”的绿色荧光蛋白结合，形成高效的荧光共振能量转移系统，被广泛用于研究细胞内分子的定位和动态变化。

相关研究

萤火虫荧光素酶在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化荧光素氧化，产生黄绿色光。

图2 荧光素酶催化荧光素氧化发光（来源于网络）

值得注意的是，荧光素酶发出的光的颜色高度依赖于包围荧光素的氨基酸。图3（左边）是来自日本萤火虫的荧光素酶的结构，它通常发出绿黄色的光。但是，如果将一个丝氨酸氨基酸改变为天冬氨酸氨基酸，光的颜色就会变为红色，如图3（右边）所示。令人惊讶的是，这种变化离荧光素还有一定的距离，颜色变化被认为是由于氨基酸包装的细微变化和荧光素周围的灵活性变化所导致的。[2]

图3 the structure of luciferase [3]

2023年2月22日，华盛顿大学蛋白质设计研究所David Baker教授团队在Nature上发表了研究论文De novo design of luciferases using deep learning，借助深度学习的“family-wide hallucination” 方法从头设计出能特异性催化底物的荧光素酶LuxSit。这是蛋白质设计领域的重要一步，从零开始设计具有广泛生物医学应用的高活性和特异性生物催化剂，也是计算酶设计的一个重要里程碑。[4]

图4 Nature 论文截图

iGEM相关研究

荧光素酶在生物感知、分子检测等方面的应用非常广泛，许多iGEM团队都在利用荧光素酶进行研究和开发应用。在iGEM的项目中，荧光素酶通常被用来标记特定的蛋白质、细胞或者基因，并且利用其荧光信号来监测其在生物体内的分布和活动状态。

BBa_I712019 是2007年由Ljubljana团队贡献，该part来自萤火虫属的荧光素酶。

2019年Munich 团队利用细胞可渗透底物D-Luciferin，在哺乳动物细胞内确定了野生型萤火虫荧光素酶BBa_I712019的平衡参数。该团队使用Gibson重组技术将BBa_I712019序列连接到一个在HEK293T细胞中优化的CAG启动子控制的骨架上（BBa_K3113200）。在测序确认后，将含有萤火虫荧光酶序列的质粒（pCAG_FLuc）转染到HEK293T细胞中。最后，使用不同的D-Luciferin浓度进行荧光素酶检测，并测量发光度。结果观察到了萤火虫荧光素酶与D-Luciferin的浓度存在相关性依赖性。

图注：Luciferase Assay to determine equilibrium binding constant of the Firefly Luciferase and Luciferin. A dilution series of D-Luciferin was prepared reaching final concentrations from 0 μM up to 4 mM of D-Luciferin and luminescence was measured for ~8h.

图注：The various D-Luciferin concentrations used throughout the luciferase assay were plotted against the averaged equilibrium values.[5]

除此之外，iGEM的parts还为大家提供了菱形珊瑚的荧光素2-单加氧酶（BBa_J52008）[6]。

参考资料

[1] Nakatsu T, Ichiyama S, Hiratake J, Saldanha A, Kobashi N, Sakata K, Kato H. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 2006 Mar 16;440(7082):372-6. doi: 10.1038/nature04542. PMID: 16541080.

[2] https://pdb101.rcsb.org/motm/78

[3] Nakatsu T, Ichiyama S, Hiratake J, Saldanha A, Kobashi N, Sakata K, Kato H. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 2006 Mar 16;440(7082):372-6. doi: 10.1038/nature04542. PMID: 16541080.

[4] Yeh AH, Norn C, Kipnis Y, Tischer D, Pellock SJ, Evans D, Ma P, Lee GR, Zhang JZ, Anishchenko I, Coventry B, Cao L, Dauparas J, Halabiya S, DeWitt M, Carter L, Houk KN, Baker D. De novo design of luciferases using deep learning. Nature. 2023 Feb;614(7949):774-780. doi: 10.1038/s41586-023-05696-3. Epub 2023 Feb 22. PMID: 36813896; PMCID: PMC9946828.

[5] http://parts.igem.org/Part:BBa_I712019

[6] http://parts.igem.org/Part:BBa_J52008