Abstart抗体修饰热启动酶的基本性质与结构

概述^[1]

Abstart Taq DNA 聚合酶是和 Taq DNA 聚合酶的混合制品。高温加热前,抗Taq单克隆抗体与 Taq聚合酶结合从而抑制聚合酶的活性,达到抑制低温条件下由引物的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增作用。当扩增反应体系被加热到95°C 2 min时,聚合酶活性因抗Taq单克隆抗体变性而得到恢复,因此无需特殊失活处理,在常规PCR反应条件下即可使用。

基本性质与结构^[2-3]

聚合酶属于聚合酶I家族，是一种耐热的聚合酶。该酶的编码基因全长有2496个碱基，编码832个氨基酸酶蛋白的分子量为94KD。酶比活性为200000U/mg。该酶的热稳定性很高，在95℃时酶活性半衰期为1.5h；在70℃的高温下反应2h后，还能保持90%以上的活性；在75-80℃时活性最高，延伸效率约为每秒150 个核苷酸。

Taq DNA聚合酶全酶共分为三个结构域，如图所示。

Taq DNA聚合酶蛋白多肽链N端1-291个氨基酸构成一个结构域，该结构域表达核酸外切瞎活性，可以水解单链或双链DNA分子5’端的单核苷酸，释放出寡核苷酸。该结构域也是二价金属离子的结合位点。

蛋白质肽链C端的第424-832个氨基酸构成另一个结构域，该结构域表达5’-3’聚合酶活性。图1-2是Taq DNA聚合酶的聚合酶活性区域与DNA结合时的晶体结构图。此结构域被形象的比作人类的右手，可分为手掌区域、拇指区域及手指区域。

其中，手掌区域是酶的催化位点，可催化磷酰基转移。引物末端的OH对插入的dNTP的α磷酰基进行亲核攻击，三羧酸盐侧链结合的金属离子（如Mg²⁺）可促进引物末端的去质子化，使dNTP的α磷酰基处形成过渡状态。在拇指区域，新合成的dsDNA的小沟与要插入的核苷酸进行相互作用，该区域保守性较低，且有大量的螺旋结构。手指区域在模板的固定和核苷酸的特异性方面具有重要作用。在进行合成反应时，引物-模板复合物首先结合于酶的拇指区域。然后，手指区域与单链相互作用，并且接纳dDTPs,每接纳一个dNTP，手指的指尖部位就位向内侧移动，从开放的状态转变成闭合的状态。之后，dNTP在酶的手掌区域与引物-模板发生聚合反应。

参考文献

[1] Abstart抗体修饰热启动酶产品介绍

[2]Taq DNA 聚合酶的结构修饰与表征.郭佳

[3]Kreader CA.Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein[J].