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Ac-YVAD-pNA (Caspase 1显色底物)

发布日期:2019/12/29 10:29:53

背景[1][2][3][4]

Ac-YVAD-pNA (Caspase 1显色底物)中Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 1也称interkeukin 1b conberting enzyme(ICE),有时被写作caspase-1或caspase 1,是caspase家族中唯一可以剪切IL-1b前体蛋白或IL-18前体产生相应成熟的细胞因子的caspase。

Caspase 11可以剪切45kD的caspase 1前体蛋白,产生20kD和10kD的片断,这两个片断可以形成异源二聚体(heterodimer),并进一步由两个异源二聚体形成四聚体。Caspase 1可以通过剪切其凋亡Bcl-XL来调节细胞凋亡,并通过其对一些细胞因子前体的剪切来调控相关免疫反应。

caspase 1可以催化底物Ac-YVAD-pNA(acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp p-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline),从而可以通过测定吸光度来检测caspase 1的活性。pNA在405nm附近有强吸收。Caspase缺乏症已被确定为肿瘤发展的原因。肿瘤生长可以通过多种因素的组合发生,包括细胞周期基因中的突变,其消除对细胞生长的限制,与凋亡蛋白(例如半胱氨酸蛋白酶)中的突变相结合,其将通过诱导异常生长细胞中的细胞死亡而作出反应。

相反,一些caspase(如caspase-3)的过度激活可导致过度的程序性细胞死亡。这可见于神经细胞丢失的几种神经退行性疾病,如阿尔茨海默病。涉及处理炎症信号的半胱天冬酶也与疾病有关。这些半胱天冬酶的激活不足可以增加生物体对感染的易感性,因为可能不会激活适当的免疫应答。

caspase在细胞死亡和疾病中发挥的不可或缺的作用导致了使用半胱天冬酶作为药物靶标的研究。例如,炎症性caspase-1与引起自身免疫疾病有关;阻断Caspase-1活化的药物已被用于改善患者的健康。此外,科学家们使用半胱天冬酶作为癌症疗法来杀死肿瘤中不需要的细胞。aspase-1活化由蛋白质库中介导,允许检测一系列致病配体。胱天蛋白酶-1激活的一些介质是:NOD状富亮氨酸重复序列(NLRS),AIM2状受体(ALRS),热蛋白和IFI16。这些蛋白质通过形成称为Inflammasomes的多蛋白激活复合物来激活胱天蛋白酶-1。

例如,NOD Like Leucine Rich Repeat NLRP3将感知来自细胞的钾离子流出。这种细胞离子不平衡导致NLRP3分子的寡聚化,形成称为NLRP3炎性体的多蛋白复合物。使前半胱天冬酶-1与其他前半胱天冬酶分子紧密接近,以二聚化并进行自身蛋白水解切割。aspase-1是激活促炎细胞因子的关键;这些作为免疫细胞的信号,使环境有利于免疫细胞募集到损伤部位。因此,Caspase-1在先天免疫系统中起着重要作用。该酶负责处理细胞因子如pro-ILβ和pro-IL18,以及分泌它们。

研究应用[5][6]

1.Ac-YVAD-pNA (Caspase 1显色底物)可用于研究胰腺癌细胞ASPC-1凋亡过程中caspase1表达水平。

研究方法:胰腺癌细胞系ASPC-1无血清培养2 4h后加入IFN-γ,于6、1 2和2 4h收集细胞,检测细胞凋亡情况(流式细胞法)和caspase-1和caspase-2蛋白质表达(western blot法),以不加IFN-γ的细胞为对照组。结果:IFN-γ刺激可诱导ASPC-1细胞的凋亡,随着时间延长凋亡数量增多,2 4h达9%。Caspase-1和caspase-2表达随时间而增强,对照组轻度表达。

结论:Caspase-1和cas-pase-2在细胞凋亡过程中表达,是重要的凋亡调节基因。

2.Ac-YVAD-pNA (Caspase 1显色底物)可用于研究Caspase1的活性改变在大鼠急性胰腺炎中性粒细胞凋亡中的作用

方法SD大鼠90只,随机分为3组(ANP组、AEP组和对照组),每组30只,ANP组逆行胰胆管注射3%牛磺胆酸钠,AEP逆行胰胆管注射0.5%牛磺胆酸钠,分别建立大鼠急性坏死性胰腺炎及水肿性胰腺炎模型;对照组仅行逆行胰胆管穿刺,不注射任何药物。

按随机原则在制模后0,3,6,12,24h分期分批处死大鼠,留取胰腺组织甲醛固定,HE染色进行病理评分,抽取下腔静脉血分离中性粒细胞,通过流式细胞仪检测PMN凋亡情况,用荧光染色法测定外周血中PMN的Caspase 1、Caspase 8的活性,用免疫组化法测定胰腺组织中Caspase 1、Caspase 8的活性。

结果:随着制模后时间的延长胰腺病变程度加重,ANP组PMN凋亡明显延迟,至术后24h降至1.87±0.41;AEP组PMN凋亡活化,术后6h即升至9.4±0.33,其后稍下降,至24h降至5.23±0.67;对照组PMN凋亡维持在6.30~6.57这一水平。ANP组及AEP组PMN及胰腺组织Caspase1活性逐步增加,且ANP组增加的幅度明显高于AEP组;PMN及胰腺组织Caspase8活性在ANP组术后3h稍增加后即逐步降低,在AEP组则持续增加。

参考文献

[1] Shalini,S.;Dorstyn,L.;Dawar,S.;Kumar,S.(2015-04-01)."Old,new and emerging functions of caspases".Cell Death&Differentiation.22(4):526–539.doi:10.1038/cdd.2014.216.ISSN 1350-9047.PMC 4356345.PMID 25526085.

[2] Goodsell,David S.(2000-10-01)."The Molecular Perspective:Caspases".The Oncologist.5(5):435–436.doi:10.1634/theoncologist.5-5-435.ISSN 1083-7159.PMID 11040280.

[3] McIlwain,David R.;Berger,Thorsten;Mak,Tak W.(2013-04-01)."Caspase Functions in Cell Death and Disease".Cold Spring Harbor Perspectives in Biology.5(4):a008656.doi:10.1101/cshperspect.a008656.ISSN 1943-0264.PMC 3683896.PMID 23545416.

[4] Eldridge,Matthew JG;Shenoy,Avinash R(2015)."Antimicrobial inflammasomes:unified signalling against diverse bacterial pathogens".Current Opinion in Microbiology.23:32–41.doi:10.1016/j.mib.2014.10.008.PMID 25461570.

[5] Caspase1、Caspase8的活性改变在大鼠急性胰腺炎中性粒细胞凋亡中的作用[D].李冈栉.四川大学.2006

[6] 胰腺癌细胞ASPC-1凋亡过程中caspase1和2的表达[J].孙海晨,钱晓明,唐文杰,吴学豪.医学研究生学报.2000(05)

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