小鼠黑色素瘤细胞的应用

背景^[1-3]

小鼠黑色素瘤细胞是一株来自C57BL/6小鼠皮肤的黑素瘤细胞，黑色素生成阳性，但大部分细胞无色素。据报道，细胞在部分培养条件下可能分泌大量黑色素。尚恩生物确认细胞使用DMEM（GIBCO 12800082）培养时出现过大量黑色素表达情况，另外无论细胞是否在体外培养时产生黑色素，接种至C57BL/6小鼠体内后，瘤体均呈黑色。B16可以用于皮肤癌研究，也是一种合适的转染宿主。

小鼠黑色素瘤细胞

小鼠黑色素瘤细胞细胞培养步骤

1、培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；小牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

2、细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4、收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

应用^[4][5]

小鼠黑色素瘤细胞可以用于SHCBP1介导白藜芦醇调控小鼠黑色素瘤细胞增殖及迁移的机制研究

白藜芦醇抑制小鼠黑色素瘤B16细胞中SHCBP1的表达水平的结果,采用CCK-8、流式细胞术、Western Blot、Ed U染色等方法阐明白藜芦醇在抑制小鼠黑色素瘤(B16)细胞的分子机制,并进一步阐明SHCBP1在B16细胞中的生物学作用。

本研究主要获得实验结果如下:1、白藜芦醇抑制B16细胞增殖、细胞集落形成和细胞迁移。这种影响是由于白藜芦醇抑制B16细胞中ERK及AKT信号通路,并促进细胞周期抑制因子p21、p27、p53蛋白的表达。同时发现白藜芦醇抑制B16细胞中SHCBP1蛋白的表达。

2、SHCBP1在B16细胞中本底表达较高。通过获得干扰SHCBP1的B16细胞株,利用转录组测序分析差异基因KEGG通路,发现差异基因主要富集在细胞增殖、凋亡、氧化及炎症相关通路,说明SHCBP1的确影响B16细胞增殖。

3、在B16细胞中单独干扰和超表达SHCBP1,结果发现SHCBP1加速B16细胞G1/S期进程,促进ERK和AKT的磷酸化,进一步影响Cyclin D1和P21的表达水平,从而调控细胞增殖过程。

4、分别在SHCBP1干扰和超表达的情况下,用白藜芦醇处理B16细胞,结果发现,白藜芦醇抑制SHCBP1的表达,调控ERK信号通路从而影响B16细胞的细胞增殖,另一方面,白藜芦醇也通过AKT信号通路发挥调控B16细胞增殖效应。

结论:本研究阐明白藜芦醇通过抑制SHCBP1/ERK和AKT信号通路抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖及迁移能力。为白藜芦醇临床治疗提供实验支撑,SHCBP1作为治疗黑色素瘤的临床诊断和靶向治疗提供理论依据和实验基础。

参考文献

[1]SHCBP1 interacting with EOGT enhances O-GlcNAcylation of NOTCH1 and promotes the development of pancreatic cancer[J].Yang Can;Hu Jian-Fei;Zhan Qian;Wang Zu-Wei;Li Ge;Pan Jing-Jing;Huang Long;Liao Cheng-Yu;Huang Yi;Tian Yi-Feng;Shen Bai-Yong;Chen Jiang-Zhi;Wang Yao-Dong;Chen Shi.Genomics,2021(2)

[2]FGF13 interaction with SHCBP1 activates AKT-GSK3α/βsignaling and promotes the proliferation of A549 cells[J]..Cancer Biology&Therapy,2020(11)

[3]NRASQ61K melanoma tumor formation is reduced by p38-MAPK14 activation in zebrafish models and NRAS-mutated human melanoma cells.[J].Banik Ishani;Cheng Phil F;Dooley Christopher M;Travnickova Jana;Merteroglu Munise;Dummer Reinhard;Patton Elizabeth E;BuschNentwich Elisabeth M;Levesque Mitchell P.Pigment cell&melanoma research,2020

[4]Curcumol inhibits the proliferation and metastasis of melanoma via the miR-152-3p/PI3K/AKT and ERK/NF-κB signaling pathways.[J].Ning Ning;;Liu Sulai;;Liu Xiehong;;Tian Zeyu;;Jiang Yu;;Yu Nanhui;;Tan Boyu;;Feng Hao;;Feng Xing;;Zou Lianhong.Journal of Cancer,2020(7)

[5]孙志阳.SHCBP1介导白藜芦醇调控小鼠黑色素瘤细胞增殖及迁移的机制研究[D].陕西理工大学,2021.