人T淋巴细胞白血病细胞的应用

背景^[1-3]

人T淋巴细胞白血病细胞来源于一个14岁的男孩的外周血。该克隆是Jurkat-FHCRC细胞株的一个克隆（Jurkat的一个衍生株），经佛波酯(phorbol esters)和外源凝集素（lectins）或抗T3单克隆抗体（需要两种物质共同诱导）诱导后可产生大量IL-2。

Jurkat细胞是一种悬浮细胞，是用于研究急性T细胞白血病，T细胞信号传导以及易感病毒进入的各种趋化因子受体，特别是HIV的表达的永生化人T淋巴细胞系。它在生物学研究上具有十分广泛的应用。

人T淋巴细胞白血病细胞

人T淋巴细胞白血病细胞培养步骤

一．人T淋巴细胞白血病细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备IMDM；优质胎牛血清，20%;P/S 1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM条件下离心4分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走），加入部分新鲜培养基，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人T淋巴细胞白血病细胞可以用于双氢青蒿素通过激活氧化应激诱导人急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡

通过观察双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对人急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)细胞生长、凋亡的影响,验证DHA是否通过激活氧化应激诱导T-ALL细胞凋亡,并探讨DHA杀伤T-ALL细胞的分子机制。以此为基础,进一步观察DHA和三氧化二砷(Arsenic trioxide,ATO)单药或联合用药对T-ALL细胞生长、凋亡的影响,比较不同组别之间的差异,探讨DHA和ATO联用是否能增加对T-ALL细胞的毒性,协同诱导细胞凋亡,然后进一步研究DHA和ATO协同促进T-ALL细胞凋亡的分子机制。

方法(1)对人T-ALL细胞株Jurkat细胞和MOLT-4细胞进行培育和传代,取对数生长期的细胞进行相关实验;

(2) 用不同浓度的DHA处理T-ALL细胞并设置对照组,观察不同组的细胞活力、增殖能力的变化(通过CCK8法、PI染色、克隆形成、Ed U染色免疫荧光等实验);

(3) 不同浓度的DHA处理T-ALL细胞并设置对照组,观察各组细胞活性氧(reactive oxygen species ROS)水平、凋亡率、凋亡蛋白C-Caspase-3活性水平的变化(通过DCFH-DA探针流式测定DCF的荧光强度、Annexin V-FITC/PI染色流式测凋亡率、免疫组化检测C-Caspase-3表达量等实验);

(4) Western blot检测DHA处理后的细胞DNA损伤蛋白及凋亡相关蛋白的表达水平变化;

(5) 用ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-cysteine,NAC)预处理细胞,再用DHA处理,并设置对照组,检测细胞ROS水平、活力、增殖能力、凋亡水平的变化,观察是ROS清除后是否能抑制DHA诱导的细胞凋亡,恢复细胞活力(采用CCK8法、流式检测ROS水平、Ed U染色免疫荧光、免疫组化C-Caspase-3活性测定等实验);

(6) DHA和ATO单药或联合处理T-ALL细胞,并设置对照组,观察各组细胞活力、增殖能力的变化,比较联合用药和单药抑制细胞生长能力的差异(采用CCK8法、Ed U染色免疫荧光等实验);

(7) 用DHA和ATO单药或联合处理及NAC预处理T-ALL细胞,用流式细胞术检测细胞的DCF荧光强度来确定确定胞内的ROS水平,比较各组之间ROS产生量;

(8) Western blot检测DHA和ATO单药或联合处理Jurkat细胞及对照组细胞的损伤蛋白γ-H2AX含量,比较各组间的γ-H2AX蛋白表达水平,评估联和用药与单药处理对细胞DNA损伤差异;

(9)观察DHA和ATO单药或联合处理T-ALL细胞后各组细胞的凋亡率水平变化,评估两药联用诱导的细胞凋亡率是否高于两种单药诱导细胞凋亡率的叠加(采用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒流式测凋亡率、免疫组化C-Caspase-3活性测定等实验);(10)ROS清除剂NAC预处理后,观察DHA和ATO联合处理的T-ALL细胞活力和增殖能力是否有所恢复(通过CCK8法和Ed U染色免疫荧光实验)。

参考文献

[1]Dihydroartemisinin Sensitizes Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells to Arsenic Trioxide via Apoptosis[J].Hongyu Chen;;Shiyan Gu;;Huangmei Dai;;Xinyang Li;;Zunzhen Zhang.Biological Trace Element Research,2017(2)

[2]Dihydroartemisin inhibits glioma invasiveness via a ROS to P53 toβ-catenin signaling[J].Zhongyou Que;;Ping Wang;;Yi Hu;;Yixue Xue;;Xiaobai Liu;;Chengbin Qu;;Jun Ma;;Yunhui Liu.Pharmacological Research,2017

[3]Dihydroartemisinin induces apoptosis in human gastric cancer cell line BGC-823 through activation of JNK1/2 and p38 MAPK signaling pathways[J].Shuyi Zhang;;Lei Shi;;Hongwen Ma;;Hongzhou Li;;Yanru Li;;Ying Lu;;Qiaoping Wang;;Wen Li.Journal of Receptors and Signal Transduction,2017(2)

[4]ROS-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction underlie apoptosis induced by resveratrol and arsenic trioxide in A549 cells[J].Shiyan Gu;;Chengzhi Chen;;Xuejun Jiang;;Zunzhen Zhang.Chemico-Biological Interactions,2016

[5]孙维栋.双氢青蒿素通过激活氧化应激诱导人急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡[D].蚌埠医学院,2020.