人神经上皮瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人神经上皮瘤细胞与HTB-11都是神经源的。1971年9月分离得到SK-N-MC后，发现它有中性多巴胺-β-羟化酶活性，也有细胞内儿茶酚胺，用甲醛可以诱导出荧光。

人神经上皮瘤细胞

人神经上皮瘤细胞培养步骤

一．人神经上皮瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1，细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人神经上皮瘤细胞可以用于胶质瘤癌基因筛选以及癌基因YAP1通过STAT3介导上皮-间质转化促进神经胶质瘤高侵袭的分子机制研究

通过筛选GBM癌基因,研究癌基因介导EMT促进神经胶质瘤高侵袭的分子机制,以期为临床开发有效的靶向治疗方案、改善预后提供理论依据。

方法:1)应用串联质谱标签(Tandem mass tages,TMT)蛋白质组学技术对5对GBM和瘤旁非肿瘤新鲜组织进行差异表达蛋白筛查,并结合多种生物信息学分析平台和GBM高侵袭高增殖特征,确定候选标记物。

2) 应用免疫组织化学方法(Immunohistochemistry,IHC)检测临床胶质瘤样本中YAP1(YAP1、p YAP1)和STAT3(STAT3、pSTAT3-S727、pSTAT3-Y705)的表达水平,分析它们与临床病理特征及预后的关系,初步评估YAP1与STAT3在组织样本中的关系。采用Sanger测序法检测IDH1基因突变,以及应用荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)检测1p19q共缺失,分析YAP1和STAT3表达在不同分子亚型中的差异。

3) 建立YAP1过表达稳转株,通过观察YAP1、STAT3对胶质瘤细胞生物学功能的影响,从细胞学初步探讨YAP1与STAT3的互作关系;应用免疫共沉淀、免疫荧光和核质分离蛋白技术观察并验证YAP1与STAT3的互作关系;从细胞水平研究YAP1通过STAT3调控胶质瘤EMT机制;观察YAP1过表达对替莫唑胺治疗效果的影响。

结果:1)通过蛋白质组学研究筛选出2387个差异表达蛋白质,其中上调差异蛋白为1206个,下调差异蛋白为1181个;本研究结合蛋白质组学结果、TCGA数据库和GBM高侵袭特征,选定Hippo信号通路中Yes相关蛋白1(YES-associated protein,YAP1)和信号转导和转录激活因子3(Signal transducers and activators of transcription,STAT3)作为候选标记物。

2)YAP1和pSTAT3-S727表达与IDH1突变状态有关,YAP1和STAT3表达与1p19q共缺失状态无关;YAP1和STAT3在GBM中高表达,其高表达与胶质瘤患者预后较差有关;YAP1和STAT3表达在胶质瘤组织样本中具有正相关。

3)细胞学研究证实YAP1和STAT3之间具有互作关系,YAP1通过STAT3促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭;YAP1通过STAT3调控胶质瘤EMT过程;YAP1高表达可降低替莫唑胺治疗疗效。

结论:YAP1通过STAT3影响胶质瘤细胞生物学行为、介导胶质瘤EMT事件以及影响替莫唑胺治疗疗效,YAP1-STAT3信号轴可成为胶质瘤靶向治疗、改善预后的重要信号通路。

参考文献

[1]The antioxidant N-acetylcysteine promotes immune response and inhibits epithelial-mesenchymal transition to alleviate pulmonary fibrosis in chronic obstructive pulmonary disease by suppressing the VWF/p38 MAPK axis[J].Zhu Lanlan;Xu Fei;Kang Xiuhua;Zhou Jing;Yao Qinqin;Lin Yang;Zhang Wei.Molecular Medicine,2021(1)

[2]Dynamic EMT:a multi-tool for tumor progression.[J].Brabletz Simone;Schuhwerk Harald;Brabletz Thomas;Stemmler Marc P.The EMBO journal,2021(18)

[3]Apolipoprotein C‐II induces EMT to promote gastric cancer peritoneal metastasis via PI3K/AKT/mTOR pathway[J].Wang Chao;Yang Zhi;Xu En;Shen Xiaofei;Wang Xingzhou;Li Zijian;Yu Heng;Chen Kai;Hu Qiongyuan;Xia Xuefeng;Liu Song;Guan Wenxian.Clinical and Translational Medicine,2021(8)

[4]A Yes-Associated Protein(YAP)and Insulin-Like Growth Factor 1 Receptor(IGF-1R)Signaling Loop Is Involved in Sorafenib Resistance in Hepatocellular Carcinoma.[J].Ngo MaiHuong T;Peng SueWei;Kuo YungChe;Lin ChunYen;Wu MingHeng;Chuang ChiaHsien;Kao ChengXiang;Jeng HanYin;Lin GeeWay;Ling ThaiYen;Chang TeSheng;Huang YenHua.Cancers,2021(15)

[5]桑伟.胶质瘤癌基因筛选以及癌基因YAP1通过STAT3介导上皮-间质转化促进神经胶质瘤高侵袭的分子机制研究[D].新疆医科大学,2021.