人肾透明细胞癌细胞的应用

背景^[1-3]

人肾透明细胞癌细胞分离自肾实质癌组织，肾实质癌是来源于肾小管上皮细胞的腺癌，85%为透明细胞癌，还有一部分为颗粒细胞癌及混合细胞癌。癌中常有出血、坏死、囊变和钙化。生于肾实质内，长大后浸润、压迫、破坏肾盂肾盏，向肾包膜外发展，形成血管瘤栓或转移到淋巴结及其他脏器。

人肾透明细胞癌细胞

人肾透明细胞癌细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备Mccoy’s 5A培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人肾透明细胞癌可以用于研究CDH23基因敲降对人肾透明细胞癌细胞形态转化及生物学行为的影响及机制

通过研究CDH23基因敲降对肾透明细胞癌细胞形态及生物学行为的影响,探讨CDH23能否促进肾透明细胞癌细胞发生肉瘤样形态转化以及对细胞增殖和侵袭的影响;通过研究CDH23敲降对细胞粘附、F-肌动蛋白和细胞骨架的影响,并检测CDH23与MAGI-1的相互作用以及EMT相关蛋白的表达,初步探讨其作为EMT候选钙粘蛋白参与上皮间质转化和肾透明细胞癌肉瘤样形态转化的分子机制。

方法:选取人肾透明细胞癌细胞系7860为实验对象,感染CDH23重组慢病毒载体,应用RT-q PCR和Western blot对CDH23干扰表达效率进行检测,选取CDH23表达下降显著的两条序列进行后续实验研究,应用HE染色和鬼笔环肽染色检测CDH23敲降对肾透明细胞癌细胞形态的影响;应用CCK-8、平板克隆和流式细胞术检测CDH23敲降对肾透明细胞癌细胞增殖的影响;应用划痕愈合实验和Transwell迁移侵袭实验检测CDH23敲降对肾透明细胞癌细胞迁移和侵袭能力的影响;通过细胞粘附、鬼笔环肽染色和细胞免疫荧光双染色实验探索CDH23基因敲降对肾透明细胞癌细胞中CDH23与MAGI-1相互作用的影响,同时通过Western blot检测E-cadherin和Vimentin的表达,研究CDH23作为EMT候选钙粘蛋白参与EMT过程的可能机制及其促进肾透明细胞癌肉瘤样形态转化的可能潜在分子机制。

结果:荧光显微镜下观察各组慢病毒感染7860细胞,荧光丰度均达到80%,通过嘌呤霉素进一步筛选获得稳定克隆细胞株,RT-q PCR和Western blot结果表明:与NC组比较,各实验组CDH23在m RNA和蛋白水平的表达均显著降低(P<0.05),提示成功构建CDH23稳定干扰表达的肾透明细胞癌细胞系,其中CDH23-sh RNA(1#)(P<0.05)和CDH23-sh RNA(3#)(P<0.01)CDH23表达下降显著;HE染色和鬼笔环肽染色实验发现CDH23敲降组细胞呈梭形、嗜酸性和成纤维细胞样,细胞形态伸长,异型性明显,提示CDH23敲降促进了肾透明细胞癌细胞的肉瘤样形态转化。

CCK-8、平板克隆和流式细胞术实验结果表明,CDH23基因敲降组细胞的增殖能力较NC组细胞无显著性差异(ns);划痕愈合实验和Transwell迁移实验结果表明CDH23敲降组肾透明细胞癌细胞的迁移能力明显增加(P<0.001),Transwell侵袭实验结果表明CDH23敲降肾透明细胞癌细胞的侵袭能力显著增加(P<0.001);细胞粘附实验表明,CDH23敲降肾透明细胞癌细胞的粘附能力显著降低(P<0.01)。

鬼笔环肽染色实验结果表明,CDH23敲降肾透明细胞癌细胞具有异常拉长的细胞形状,F-肌动蛋白丝聚集,片状及丝状伪足增加;细胞免疫荧光双染色实验结果表明CDH23敲降的肾透明细胞癌细胞CDH23与MAGI-1共定位率显著降低(P<0.01);CDH23敲降肾透明细胞癌细胞上皮间质转化过程相关蛋白发生显著变化,其中E-cadherin表达显著下降,Vimentin表达显著上升(P<0.01)。

结论:CDH23表达下调能够促进肾透明细胞癌细胞肉瘤样形态转化,细胞迁移和侵袭能力增加,细胞粘附性显著降低,F-肌动蛋白丝聚集,片状及丝状伪足增加,CDH23与MAGI-1相互作用减少,并影响EMT相关蛋白表达。CDH23作为一个新的EMT候选钙粘蛋白参与肾透明细胞癌细胞EMT过程,促进肾透明细胞癌细胞发生肉瘤样形态转化,增加肿瘤细胞迁移及侵袭能力。CDH23有可能成为透明细胞肾细胞癌伴肉瘤样分化临床靶向治疗的新指标。

参考文献

[1]Cellular dynamics of EMT:lessons from live in vivo imaging of embryonic development.[J].Amack Jeffrey D.Cell communication and signaling:CCS,2021(1)

[2]Methylation silencing CDH23 is a poor prognostic marker in diffuse large B-cell lymphoma.[J].Cao Baoping;Guo Xiaochuan;Huang Lefu;Wang Bin;Wang Weixia;Han Dong;Zhang Weijing;Zhong Kaili.Aging,2021(unde)

[3]MAGI1,a Scaffold Protein with Tumor Suppressive and Vascular Functions[J].W?rthmüller Janine;Rüegg Curzio.Cells,2021(6)

[4]A novel highly frequent single?nucleotide polymorphism site of cadherin 23 in clear cell renal cell carcinoma with sarcomatoid differentiation based on whole exome sequencing.[J].Yu Wenjuan;;Wang Xiaohui;;Wang Yuewei;;Jiang Yanxia;;Zhang Wei;;Shi Hailei;;Li Yujun.Oncology reports,2020(2)

[5]杨静.研究CDH23基因敲降对人肾透明细胞癌细胞形态转化及生物学行为的影响及机制[D].青岛大学,2022.