仓鼠肺细胞的应用

背景^[1-3]

仓鼠肺细胞源自一只雌性中国仓鼠的肺组织，原名V细胞株，1958年Elkind将其改名为V79并用于研究培养中的哺乳动物细胞的X-放射线诱导的损伤及修复。该细胞免疫球蛋白产物和EB病毒表达为阴性。该细胞表达Fas抗原且对TNF和抗-Fas抗体敏感。

仓鼠肺细胞

仓鼠肺细胞细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．仓鼠肺细胞细胞处理：

1）冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4][5]

仓鼠肺细胞可以用于DDT对中国仓鼠肺成纤维细胞（V79）遗传毒性的研究

研究DDT对中国仓鼠肺成纤维细胞V79的遗传毒性。

方法:MTT法测定细胞活性,集落形成试验检测细胞增殖,微核实验测定细胞毒性,染色体畸变分析检测细胞遗传损伤。

结果:与溶剂对照组相比,MTT法结果显示,分别处理4h、8h、12h、24h时6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT均可降低V79细胞的活性,与10μg/ml CP的作用类似,有统计学意义(P<0.05),并表现出良好的剂量效应关系和时间效应关系。集落形成实验结果显示,处理4h、8h、12h、24h时12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT可抑制V79细胞的增殖,与10μg/ml CP的作用类似具有统计学意义(P<0.05),具有良好的剂量效应和时间效应关系。

微核实验结果表明,在无体外活化系统S9参与时,DDT各浓度组对V79细胞微核率结果无统计学意义(P>0.05),表明DDT对V79细胞无明显DNA损伤,没有表现出遗传毒性;添加S9以后,6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT均对V79细胞有显著的遗传毒性,此结果有统计学意义(P<0.05),且在6.25μg/ml、50.00μg/ml剂量时呈现剂量效应关系,该关系有统计学意义(P<0.05)。

染色体畸变试验结果显示,在不添加S9时,DDT各浓度组对V79细胞染色体畸变效果无统计学意义(P>0.05),视为对细胞染色体没有造成损伤,无明显致畸作用;在有S9系统参与以后,6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml、50.00μg/ml DDT均对V79细胞染色体畸变有显著影响,该影响有统计学意义(P<0.05),可造成细胞染色体损伤,且在6.25μg/ml、50.00μg/ml剂量时具有剂量效应关系。

结论:DDT具有与环磷酰胺相似的细胞毒性,能够降低V79细胞的细胞活性,抑制细胞增殖。在体外活化系统S9作用下,DDT可促使V79细胞微核率和染色体畸变发生率的增加,而无体外活化系统S9时此作用不明显。其作用机制可能是在细胞有丝分裂的过程中,造成DNA和染色体的损伤,致使染色体发生突变、断裂,从而表现出潜在的致畸作用。

参考文献

[1]Organochlorine Pesticides,Polychlorinated Biphenyls,and Polybrominated Diphenyl Ethers in Irrawaddy Dolphins from India[J].K.Kannan;K.Ramu;N.Kajiwara;R.K.Sinha;S.Tanabe.Archives of Environmental Contamination and Toxicology,2005(3)

[2]Progress in study on endocrine disrupting pesticides(EDPs)in aquatic environment[J].Nandong Xue;;Hongbo Wang;;Xiaobai Xu.Chinese Science Bulletin,2005(20)

[3]Determination of polybrominated diphenyl ethers in marine biological tissues using microwave-assisted extraction[J].Stéphane Bayen;;Hian Kee Lee;;Jeffrey Philip Obbard.Journal of Chromatography A,2004(2)

[4]Sperm chromatin structure assay(scsa?)parameters are related to fertilization,blastocyst development,and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles[J].Michael R Virro;;Kjersten L Larson-Cook;;Donald P Evenson.Fertility and Sterility,2004(5)

[5]喻琳.DDT对中国仓鼠肺成纤维细胞（V79）遗传毒性的研究[D].重庆医科大学,2010.