人非小细胞肺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人非小细胞肺癌细胞是1972年由GiardDJ通过肺癌组织移植培养建系的，源自一位58岁的白人男性。A549能通过胞苷二磷脂酰胆碱途径合成富含不饱和脂肪酸的卵磷脂；角蛋白阳性。

人非小细胞肺癌细胞

非小细胞肺癌（NSCLC）是除小细胞肺癌（SCLC）以外、所有来源于肺上皮的各种类型癌症的集合体。NSCLC的常见类型有鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，其他少见类型。这些类型都有各自的组织学亚型。虽然NSCLC与抽烟有关，但从不抽烟者也会患肺腺癌。

与小细胞肺癌相比，NSCLC对化疗和放疗相对不敏感。早期的可切除肺癌，手术或手术联合化疗，可使部分患者得以治愈。

对于多数不能手术切除的患者者，放疗可使大多数得以局部控制，其中的少数人也有治愈的机会。局部进展期患者经过放疗联合化疗的综合治疗也可得以长期生存。晚期转移性疾病，适合化疗、靶向药物及支持治疗，从而可以达到改善生存、缓解症状的目的。

培养基及培养冻存条件准备

1）准备1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

细胞处理

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

将细胞悬液按1：2到1:5比例分到新皿中或者瓶中，补加培养基至6ml，放入培养箱继续培养。次传代推荐传代密度为1:2。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1，细胞冻存时，取上清，可使用血球计数板计数。

2，4min，1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度1-2xE6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转氮入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人非小细胞肺癌细胞可以用于枸杞多糖对人非小细胞肺癌细胞增殖影响及其磷酸化蛋白质组学分析

设计制备了两种新型亲和纳米探针(TiO2/ZrO2@MoS2和MOF-808),实现对肿瘤细胞中磷酸化肽的选择性富集,并深入探究枸杞多糖对人非小细胞肺癌细胞凋亡中磷酸化蛋白质组学表达的影响,为肺癌的治疗寻找新的药物靶点。

具体实验内容如下:(1)通过简单的水热法,成功制备了一种双极金属氧化物亲和纳米探针(TiO2/ZrO2@MoS2)基于超高效液相色谱(UHPLC)-线性离子阱质谱(MSn)和Proteome Discover软件对生物样品中磷酸化肽进行鉴定。检测分析发现该探针对单/多磷酸化肽的富集具有高选择性(β-casein/BSA=1:2000)、高灵敏度(1 fmol·μL-1)和较高的负载能力(25 mg·g-1)。将其进一步用于脱脂牛奶、人血清和A549细胞蛋白酶解液中磷酸化肽的富集,均表现出良好的富集能力,表明TiO2/ZrO2@MoS2双极亲和探针可实现高效的磷酸化肽富集,这为设计高性能的识别磷酸化肽亲和探针提供新策略,有望进一步推动其在磷酸化蛋白组学研究中的应用。

(2) 通过水热法制备了一种基于Zr的金属有机骨架MOF-808,将其作为一种新型吸附剂,用于选择性富集和有效分离生物样品中的磷酸化肽。研究发现,MOF-808对磷酸化肽的吸附更符合准二级动力学模型,对磷酸化肽的富集具有高选择性(β-casein/BSA=1:5000)、高灵敏度(0.1 fmol·μL-1)和高负载能力(500 mg·g-1),这主要归因于MOF-808骨架节点裸露的Zr4+离子与磷酸化肽中磷酸根(-PO43-)之间的强配位作用。此外,MOF-808纳米材料在富集H1299细胞酶解液中的磷酸化肽时,展现出富集磷酸化肽的潜力。因此,MOF-808亲和微球(0.25μm)选择性富集磷酸化肽的研究,为磷酸化蛋白质组学分析中磷酸化肽的富集提供新方法。

(3) 采用水提醇沉结合透析法提取纯化枸杞多糖。以非小细胞肺癌细胞为体外模型,考察了枸杞多糖对非小细胞肺癌细胞生长的影响。CCK-8的实验结果表明,枸杞多糖可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖;Western-blot结果表明枸杞多糖作用于非小细胞肺癌细胞,诱导与凋亡相关的蛋白Bcl-2和BAX分别呈降低和增加的表达趋势。以非小细胞肺癌模型鼠为体内模型,考察了枸杞多糖的体内抗肿瘤作用,结果表明,枸杞多糖的体内抗肿瘤作用并不明显。结合免疫组化法对凋亡相关蛋白Bcl-2和BAX进行分析,发现枸杞多糖能够通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤的生长,与体外结果一致。这为进一步探讨枸杞多糖抑制非小细胞肺癌细胞增殖的分子机制提供了理论依据。

(4)基于体内外实验,采用TMT同位素标记定量联合生物信息学技术,全面分析了非小细胞肺癌细胞在经过枸杞多糖作用后的磷酸化蛋白质组学特征。通过磷酸化蛋白质组学分析,筛选出差异磷酸化修饰蛋白,进行亚细胞结构定位、GO富集、KEGG信号通路、蛋白结构域富集和蛋白互作网络分析等,探究枸杞多糖对非小细胞肺癌细胞后的相关凋亡蛋白的影响。为非小细胞肺癌的治疗寻找药物靶点,同时也为非小细胞肺癌的临床治疗提供理论依据。

参考文献

[1]A novel molybdenum disulfide nanosheet loaded Titanium/Zirconium bimetal oxide affinity probe for efficient enrichment of phosphopeptides in A549 cells[J].Ma Zong-Qin;Wang Ying-Hui;Peng Yuan;Guo Xin;Meng Zhe.Journal of Chromatography B,2022

[2]Mitochondrial DNA mutations are involved in the acquisition of cisplatin resistance in human lung cancer A549 cells.[J].Horibe Sayo;Ishikawa Kaori;Nakada Kazuto;Wake Masaki;Takeda Norihiko;Tanaka Toru;Kawauchi Shoji;Sasaki Naoto;Rikitake Yoshiyuki.Oncology reports,2022(2)

[3]Advances in the Extraction,Purification,Structural Characteristics and Biological Activities of Eleutherococcus senticosus Polysaccharides:A Promising Medicinal and Edible Resource With Development Value[J].Li Xiaojie;Chen Cai;Leng Aijing;Qu Jialin.Frontiers in Pharmacology,2021

[4]Evolution of the folding landscape of effector caspases.[J].Shrestha Suman;Clark A Clay.The Journal of biological chemistry,2021(5)

[5]马宗琴.枸杞多糖对人非小细胞肺癌细胞增殖影响及其磷酸化蛋白质组学分析[D].宁夏大学,2022.