甘露聚糖肽原料药的制备工艺

背景技术

甘露聚糖肽，曾用名多抗甲素，是由链长有所差异的甘露聚糖肽分子构成的混合物，结构中含有39：1的甘露糖与葡萄糖，蛋白质的含量在4.5%~6.2%之间，游离的氨基酸和小分子糖均不存在于甘露聚糖肽分子中。蛋白质中存在的主要氨基酸成分为天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸等。甘露聚糖肽是无定形的粉末，颜色为微黄色或类白色，化学性质稳定，易溶于水而不溶于有机溶剂。

目前，市场上出售的甘露聚糖肽产品是α~溶血性链球菌33#菌株经深层培养，提取精制所获得的，其中，α~溶血性链球菌33#菌株来自于健康人的口腔，化学成分分析为a~甘露聚糖肽。

通常情况下，α~溶血性链球菌的发酵产物中甘露聚糖肽是重均分子量在1~100万的甘露聚糖肽混合物，经研究者发现，通过截流法得到的重均分子量为1~20万的甘露聚糖肽的药理活性比原有重均分子量的甘露聚糖肽高，成分更加清楚且疗效较好。因此，采用截流法制备甘露聚糖肽。其制备方法主要包括发酵、提取、分离及干燥等步骤，例如：CN101186941B公开了一种高纯度甘露聚糖肽的制备方法，包括如下步骤：制备发酵产物，提取及粗品的制备，大分子甘露聚糖肽的分离，大分子甘露聚糖肽的水解。该发明经过超滤、水解步骤，制备的甘露聚糖肽纯度高，可达90~98％。CN1172952C公开了一种甘露聚糖肽组合物及其制备工艺和用途。甘露聚糖肽组合物为α~溶血性链球菌的发酵产物，主要由甘露聚糖肽组成，重均分子量1~20万；其制备方法包括下列步骤：以α~溶血性链球菌为生产菌种进行发酵；从发酵液提取甘露聚糖肽；进一步分离得到重均分子量1~20万，分子量分布系数在4.0以下的甘露聚糖肽。

α~甘露聚糖肽以甘露聚糖、碱性多肽及甘露寡糖的形式产生生理作用。

(1)甘露聚糖的功能

a、甘露聚糖可以吸附病原菌。低聚甘露糖和沙门氏菌一起培养能够出现凝集现象，阻断病原菌的致病过程。寡聚糖与病原菌产生凝集素结合具有特异性。这一结论是相关研究者研究甘露聚糖肽对肉鸡沙门氏菌感染能力的影响时发现的。b、可以为有益菌提供营养。有益菌能够特别好的与甘露寡糖中的α~1，4糖苷键结合，使得有益菌快速大量的繁殖；甘露寡糖中的α~1，4糖苷键不能被有害菌利用，有害菌因此无法生长繁殖而死亡。c、可以调节免疫功能。研究表明，甘露聚糖发挥免疫调节作用是由于其分子中的磷酸成分，磷酸成分在免疫调节功能中可以起到重要作用。肿瘤坏死因子具有抑制肿瘤细胞的作用，白细胞介素具有免疫活性，肿瘤细胞可以被一氧化氮直接杀死，而上述三种因素可以在低聚甘露糖的影响下而被刺激增多。低聚甘露糖中的磷酸成分很高时，血清中的溶菌酶水平也同时有所提高。d、结合霉菌毒素能极大降低动物营养成分，而酯代葡甘露聚糖是一种较好的霉菌毒素结合剂。试验证明，甘露聚糖可以减少霉菌素对人及动物的毒副作用，使霉菌素的免疫抑制作用有所降低。e、在较低pH值的环境下，不利于肠道中的有害菌的生长繁殖。但甘露寡糖通过发酵生成的短链脂肪酸会降低消化道的酸碱值，所以，有害菌不能生长。甘露寡糖产生的短链脂肪酸同时可以增强消化道的蠕动，使营养物质能够充分被消化利用。

(2)碱性多肽的功能

碱性多肽的功能肽生理学作用颇多。肽聚糖是细菌的细胞壁成分，细胞壁中的聚糖链是通过N~乙酰葡胺与N~乙酰胞壁酸连接的。当碱性多肽和肽聚糖发生作用之后，聚糖链的连接键会被切断，被切断后细菌被裂解而死亡。碱性多肽可以使淋巴细胞、脾细胞增殖能力增强，巨噬细胞的吞噬能力增强，从而使机体的免疫作用提高。

基于其优异的生理功能，甘露聚糖肽在治疗恶性肿瘤、皮肤疾病、呼吸道感染及白细胞减少症等临床应用领域也取得了显著的发展和进步，而且临床需求不断扩大，这也为甘露聚糖肽的提取分离工艺提出了更高的要求，这就需要从各方面进行研究，包括方法创新、育种技术和发酵工艺的改进等。

目前，甘露聚糖肽制剂主要有口服液、片剂、小针剂。然而由于甘露聚糖肽的现有剂型中主药含量较小，并且现有注射用甘露聚糖肽在临床使用时容易造成二次污染，易发生输液反应，有时也会发生差错而产生医疗事故，所以存在对大剂量、并且能够避免二次污染的甘露聚糖肽新剂型的需要。专利CN100413510C提供了一种甘露聚糖肽注射剂，它是由甘露聚糖肽为活性成分，加上药学上可接受的注射用附加剂制备而成的注射剂，其中，每1mg注射剂中含有毒素量应小于30EU，同时还提供了甘露聚糖肽注射剂的制备方法。专利CN1429558A提供了一种甘露聚糖肽注射液，其中含有甘露聚糖肽，等渗物质，其余为水，其中，所含甘露聚糖肽的浓度在注射液中为1mg/L~2000mg/L，并且每支或者每瓶中所装所述注射液的体积为50~1000ml，含有的甘露聚糖肽的有效量为1~500mg，同时还提供了甘露聚糖肽注射液的制备方法。

制备工艺

步，步骤D、滤液浓缩：对离心过滤所得滤液通过双效外循环蒸发器进行浓缩，控制温度为85℃，表压力为0.03Mpa，真空度为-0.05Mpa，浓缩至比重为1.13，得到含有甘露聚糖肽发酵产物的浓缩液。

第二步，提纯精制：

A、在步所得浓缩液中，加入体积量为浓缩液1倍的95%的乙醇，充分搅拌30分钟，降温，保持温度≤10℃，静置18小时进行沉淀，离心10分钟，收集沉淀物；

B、加入体积量为沉淀物2倍量的纯化水，搅拌溶解，并升温至48℃，停止搅拌，静置10小时，离心10分钟，弃去沉淀物，收集清液；

C、将清液加20%（wt%）的盐酸溶液调PH值至1.6，开启冰盐水，降温，保持温度为4℃，静置10小时，离心10分钟，弃去沉淀物，收集清液；

D、将步骤C所得清液按照步骤A、B、C反复操作两次至中间检测合格为止，得到甘露聚糖肽清液；

E、加入体积量为步骤D所得清液1倍的95%的乙醇，充分搅拌30分钟，降温，保持温度≤10℃，静置18小时进行沉淀，离心10分钟，收集沉淀物，即得甘露聚糖肽湿品；

第三步，真空干燥：将第二步所得甘露聚糖肽湿品进行真空干燥，温度为68℃，真空度为-0.06Mpa，干燥时间为2小时，控制水分的质量百分含量≤4.8%，即得甘露聚糖肽干品。

本实施例所描述的甘露聚糖肽原料药的制备工艺，优选的，还包括将甘露聚糖肽原料药进行内、外双包装，得到甘露聚糖肽原料药的成品；然后密闭，置于阴凉处保存。

经检测，甘露聚糖肽原料药的纯度为96.5%，比旋度均值为+78°，重均分子量为68045，分子量分布宽度指数为1.35，异常毒性及细胞内毒素检测指标符合中国药典2000年版的相关规定。

所制备的甘露聚糖肽原料药属免疫增强药，用于治疗免疫功能低下，辅助治疗反复呼吸道感染、白细胞减少症、再生障碍性贫血及肿瘤。优选的，可用于制备甘露聚糖肽口服液。具体的，所述甘露聚糖肽口服液，包括重量份的以下原料，甘露聚糖肽原料药1份、氯化钠4份、纯化水1000份、碳酸氢钠适量。其中，所述碳酸氢钠的含量根据调节所述配液步骤的PH值消耗的量进行控制，且量不超过15g/kg甘露聚糖肽原料药。

所述甘露聚糖肽口服液的各原辅料质量标准同实施例一按照表2执行。所述甘露聚糖肽口服液的制备工艺及应用同实施例一，所不同的是，配液步骤中控制PH值为5.5~6.5。