SPC-A1细胞系|人肺腺癌细胞系的应用

背景^[1-3]

SPC-A1细胞系人肺腺癌细胞系是一株常用的肺癌细胞系，也被用于肺癌发病机理和抗肿瘤药物的体外研究试验研究；SPC-A-1细胞具有典型的上皮细胞状形态结构。从一例男性原发性肺腺癌患者手术中,取得胸膜转移结节,经离体培养建成细胞系,定名为:SPC-A-1。

SPC-A1细胞系人肺腺癌细胞系

SPC-A1细胞系人肺腺癌细胞系培养操作

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

SPC-A1细胞系人肺腺癌细胞系可以用于体外探究脱落酸对肺腺癌细胞系Spc-A1自噬的影响

采用体外培养的方法，加入ABA作为干预因素，进一步探究自噬在肺癌细胞系Spc-A1中的作用及其可能机制。

以人肺腺癌细胞系Spc-A1为对象，加入不同浓度ABA进行干预，检测ABA作用后细胞活力的变化；将GFP-LC3质粒转染入Spc-A1中，加入ABA进行培养，用激光共聚焦显微镜观察不同处理浓度下细胞的自噬现象；分别从mRNA及蛋白水平检测对照组及各处理组Beclin-1及LC3-II的表达，明确ABA对Spc-A1自噬相关指标表达的影响；对实验结果进行统计学分析，探讨ABA对Spc-A1自噬的影响对肺癌新型治疗的意义。

方法1.细胞培养将Spc-A1细胞培养于含10%胎牛血清的DF-12培养基中，37℃,5%CO2，每2-3天传代一次，保持细胞处于对数生长期。

2. MTT法检测ABA作用下Spc-A1细胞活力收集对数生长期的Spc-A1细胞，调整细胞密度为500010000个/ml，种于96孔板中，待细胞贴壁后，加入ABA使培养浓度分别为进行培养，24小时后，加入MTT，用酶标仪检测各孔吸光值，根据吸光值计算出相对细胞活力。

3. 细胞转染及自噬观察取对数生长期的Spc-A1细胞传代至细胞培养皿，待细胞贴壁后按Lipofectamine2000说明书转染入GFP-LC3，6h后换正常培养基并加入浓度分别0.8μM、20μM、100μM的ABA，37℃、5%CO2培养箱中培养，24h后使用后激光共聚焦显微镜观察转染Spc-A1细胞的自噬情况。

4. 荧光实时定量PCR检测自噬相关基因表达分别抽取各处理组总RNA，将mRNA逆转录为cDNA后采用实时定量荧光PCR法分别检测Beclin-1及LC3-II基因水平表达的变化。

5. Western-Blot检测自噬相关蛋白的表达分别抽取各处理组总蛋白，然后采用Western-Blot法分别检测Beclin-1及LC3-II基因水平表达的变化。6.统计学方法所有试验至少分3次独立完成，数据用x±s表示。多组间的差异用one-wayANOVA分析，两组之间的差异用t检验，统计在SPSS15.0软件统计包中进行，P＜0.05表示差异有显著性。

结果1.ABA作用于Spc-A1细胞后细胞活力受到抑制Spc-A1细胞经浓度为0.8μM、20μM、100μM的ABA处理后，用MTT比色法，各处理组测得细胞活力相对百分比分别为：89.9%±2.4%，77.1%±0.5%，64.9%±2.8%，各处理组细胞活力与对照组差异具有显著性(P<0.001)。

2.Spc-A1细胞在ABA的作用下自噬增多Spc-A1细胞转染入GFP-LC3质粒，经终浓度为0.8μM、20μM、100μM的ABA处理24h后观察，可见带有绿色点状荧光的LC3表达较未加入ABA处理的细胞显著增多，表明在ABA的作用下Spc-A1细胞的自噬增强。

3.ABA作用后增加了Spc-A1细胞中Beclin-1及LC3-II mRNA的表达量Spc-A1细胞经终浓度为0.8μM、20μM、100μM的ABA处理后，提取细胞总RNA并反转为相应cDNA进行荧光实时定量PCR实验。

参考文献

[1]Microautophagy of Cytosolic Proteins by Late Endosomes[J].Ranjit Sahu;;Susmita Kaushik;;Cristina C.Clement;;Elvira S.Cannizzo;;Brian Scharf;;Antonia Follenzi;;Ilaria Potolicchio;;Edward Nieves;;Ana Maria Cuervo;;Laura Santambrogio.Developmental Cell,2011(1)

[2]Ubiquitination-mediated autophagy against invading bacteria[J].Naonobu Fujita;;Tamotsu Yoshimori.Current Opinion in Cell Biology,2011(4)

[3]Cigarette Smoke Synergizes Lipopolysaccharide-Induced Interleukin-1[Beta]and Tumor Necrosis Factor-[alpha]Secretion from Macrophages via Substance P-Mediated Nuclear Factor-[kappa]B Activation[J].Xu,Junyang;Xu,Fadi;Lin,Yong.American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology,2011(3)

[4]Suppression of autophagy permits successful enzyme replacement therapy in a lysosomal storage disorder—murine Pompe disease[J].Nina Raben;;Cynthia Schreiner;;Rebecca Baum;;Shoichi Takikita;;Sengen Xu;;Tao Xie;;Rachel Myerowitz;;Masaaki Komatsu;;Jack H.Van Der Meulen;;Kanneboyina Nagaraju;;Evelyn Ralston;;Paul H.Plotz.Autophagy,2010(8)

[5]邵丽洁.体外探究脱落酸对肺腺癌细胞系Spc-A1自噬的影响[D].安徽医科大学,2012.