核酸组蛋白（小牛胸腺）的应用

背景^[1-3]

核酸组蛋白（小牛胸腺）以新鲜小牛胸腺组织为原料，经乙醇和盐酸提取后，经透析、沉淀制备的产品。核酸组蛋白（小牛胸腺）水解后碱性氨基酸含量大于30%，全组蛋白包括五个电泳带：H1、H2A、H2B、H3、H4。

核酸组蛋白（小牛胸腺）在遗传学领域中用于组蛋白的结构与功能研究中作标准和原料。

组蛋白（histone）是真核生物体细胞染色质与原核细胞中的碱性蛋白质，和DNA共同组成核小体结构。它们是染色质的主要蛋白质组分，作为DNA缠绕的线轴，并在基因调控中发挥作用，但是原核细胞组蛋白对基因调控的作用非常微弱。没有组蛋白，染色体中未缠绕的DNA将非常长（人类DNA中的长宽比超过1000万比1）。例如，每个人类二倍体细胞（含有23对染色体）具有约1.8米长的DNA，但是在组织蛋白上缠绕它具有约90微米（0.09毫米）的染色质，当在有丝分裂期间复制和浓缩时，其导致约120微米的染色体。

核酸组蛋白（小牛胸腺）

真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质，含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸特别多，二者加起来约为所有氨基酸残基的1/4。组蛋白与带负电荷的双螺旋DNA结合成DNA-组蛋白复合物。因氨基酸成分和分子量不同，主要分成5类。

组蛋白的甲基化修饰主要是由一类含有SET结构域的蛋白质来执行的，组蛋白甲基化修饰参与异染色质形成、基因印记、X染色体失活和转录调控等多种主要生理功能，组蛋白的修饰作用是表观遗传学研究的一个重要领域。组蛋白甲基化的异常与肿瘤发生等多种人类疾病相关，可以特异性地激活或者抑制基因的转录活性。研究发现，组蛋白甲基转移酶的作用对象不仅仅限于组蛋白，某些非组蛋白也可以被组蛋白甲基转移酶甲基化，这将为探明细胞内部基因转录、信号转导、甚至个体的发育和分化机制提供更广阔的空间。

组蛋白的基因非常保守。亲缘关系较远的种属中，四种组蛋白（H2A、H2B、H3、H4）氨基酸序列都非常相似，如海胆组织H3的氨基酸序列与来自小牛胸腺的H3的氨基酸序列间只有一个氨基酸的差异，小牛胸腺的H3的氨基酸序列与豌豆的H3也只有4个氨基酸不同。不同生物的H1序列变化较大，在某些组织中，H1被特殊的组蛋白所取代。如成熟的鱼类和鸟类的红细胞中H1则被H5所取代，精细胞中则由精蛋白代替组蛋白。染色质中的组蛋白与DNA的含量之比为1:1。

真核生物细胞核中组蛋白的含量约为每克DNA 1克，大部分真核生物中有5种组蛋白，两栖类、鱼类和鸟类还有H5以替代或补充H1。染色质是由许多核小体组成的，H2A，H2B，H3和H4各2个分子构成的8聚体是核小体的核心部分，H1的作用是与线性DNA结合以帮助后者形成高级结构。组蛋白是已知蛋白质中最保守的，例如，人类和豌豆的H4氨基酸序列只有两个不同，人类和酵母的H4氨基酸序列也只有8个不同，这说明H4的氨基酸序列在约10^9年间几乎是恒定的。

应用^[4][5]

核酸组蛋白（小牛胸腺）可以用于痕量铜离子检测方法以及检测组蛋白甲基化试纸条的构建

基于具有催化活性的脱氧核糖核酸酶构建了两种用于铜离子检测的生物传感器,包括以DNA自组装的非酶扩增荧光生物传感器以及基于点击化学和G四聚体的比色生物传感器；以单链DNA标记的胶体金为信号增强探针,构建了一种新型的信号增强的试纸条生物传感器,可用于组蛋白甲基化的快速检测。

具体包括以下三方面的内容：(1)利用自组装的双链DNA串联体和SYBR GreenⅠ染色法构建了非酶扩增的铜离子检测方法。反应机制基于铜离子能够特异性地识别并切断与铜离子依赖型DNA酶链杂交的底物链,释放出的靶核酸能够启动DNA自组装为长的双链DNA,SYBR GreenⅠ染色后检测荧光强度。实验中,检测信号的放大不需要使用蛋白酶,实验操作简单方便。对铜离子的检测限为12.8pM,远低于美国环境保护局规定的饮用水中允许量20gM。

(2) 利用基于点击化学和具有辣根过氧化物酶活性的G四聚体的比色法构建了一种铜离子快速检测生物传感器。在反应体系中使用点击化学使修饰有叠氮基团和炔基基团的两条DNA序列形成G四聚体形成序列,之后加入高铁血红素和KCl,形成高铁血红素/G四聚体结构。由于高铁血红素/G四聚体具有HRP的活性,能催化其无色底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine,TMB)形成有颜色的底物,实验结果通过肉眼就能判别。定量分析时,将反应终溶液转移到酶标板中,用酶标仪读取溶液在450nm的光密度(Optical density,OD)值。对铜离子检测限为5.9nM,远低于美国环境保护局规定的饮用水中铜离子浓度的允许浓度20μM。检测体系简单迅速,特异性好,不受其他物质的干扰,结果肉眼可读,适合在基层实验室使用。

(3)使用核酸标记的胶体金作为信号增强探针,构建了一种信号增强的试纸条生物传感器可用于组蛋白甲基化的快速、灵敏检测。传感器中用到了两种带有不同标记的胶体金颗粒：包括标记有单链DNA的金颗粒(信号增强探针)和同时标记有单链c-DNA和单克隆抗体的金颗粒(双标金颗粒),其中DNA的序列与c-DNA互补。实验时,首先通过双抗夹心法捕获蛋白,在检测线上形成三明治夹心复合物的结构,即抗体-蛋白-双标的金颗粒,则检测线因为胶体金颗粒的聚集而显红色。接着,再加入信号增强探针,这种金颗粒通过DNA和c-DNA的杂交而被固定在检测线区域,此时有更多的胶体金聚集,检测线的显色被加深。HeLa细胞中的组蛋白H3K9m3(tri-methylated lysine9of histone H3)被选来作为信号增强的试纸条检测的模型。实验结果表明,此方法在20ng的HeLa细胞组蛋白提取液中就能检测到H3K9me3,比传统的试纸条和western blot的灵敏度分别提高了10倍和15倍。并且这种信号增强的试纸条生物传感器具有普遍适用性,可以用来检测其他类型的组蛋白甲基化,如单甲基化、二甲基化和三甲基化的H3K4和H3K9,以及各种不同的物质,如核酸,蛋白,病毒,微生物和小分子等。

参考文献

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[3]Improved rolling circle amplification(RCA)of hepatitis B virus(HBV)relaxed-circular serum DNA(RC-DNA)[J].Nora Martel;;Selma A.Gomes;;Isabelle Chemin;;Christian Trépo;;Alan Kay.Journal of Virological Methods,2013(2)

[4]Sensitive detection of copper(II)by a commercial glucometer using click chemistry[J].Jiao Su;;Jin Xu;;Ying Chen;;Yun Xiang;;Ruo Yuan;;Yaqin Chai.Biosensors and Bioelectronics,2013

[5]葛晨晨.痕量铜离子检测方法以及检测组蛋白甲基化试纸条的构建[D].中国科学技术大学,2014.