乳糖蛋白胨培养液的应用

背景^[1-3]

乳糖蛋白胨培养液可根据GBT5750.12-2006生活饮用水标准检验方法微生物指标用于饮用水，水源水中总大肠菌群的测定。

成分（g/L）：蛋白胨 10.0g；牛肉浸膏：3.0g；乳糖：5.0g；化钠：5.0g；溴甲酚紫：0.016g；PH值：7.3±0.1。

乳糖蛋白胨培养液检验原理：蛋白胨、牛肉浸膏提供碳氮源及矿物质；乳糖是可发酵的糖类；氯化钠维持均衡的渗透压；溴甲酚紫为pH指示剂，酸性呈黄色，碱性呈紫色。

乳糖蛋白胨培养液

乳糖蛋白胨培养液用法：称取本品2.3克，加热溶解于100ml蒸馏水中，分装到有倒立发酵管的20mm×150mmm试管中，每管10ml，115℃高压灭菌20分钟备用。

总大肠菌群，表示水、土壤、乳品或清凉饮料直接或间接受人、畜粪便污染程度的一种指标。指单位容积(升)或单位重量(克)样品中所含总大肠菌群的数量。总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧菌,在37℃生长时能使乳糖发酵,在24小时内产酸、产气的革兰阴性无芽孢杆菌。我国生活饮用水水质卫生规范中规定每100毫升水样中不得检出。

常见的肠道传染病病原体有痢疾杆菌、伤寒和副伤寒杆菌、霍乱弧菌、致病性大肠杆菌、空肠弯曲菌、肠炎耶氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌．葡萄球菌和甲型肝炎病毒、戌型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、诺沃尔克病毒、人轮状病毒以及阿米巴原虫等。

天然水体中含有多种微生物，要判断水质中是否含有病原微生物、需检测每一种病原微生物，由于种类多和检测困难的原因，实际工作中很难做到。人和其它温血动物，如牛、羊、狗等的肠道存在大量的总大肠菌群，如果饮用水受到粪便污染时，容易在水体中检测到，总大肠菌群的检测方法也简单易行;并且总大肠菌群对消毒剂的抵抗力与其他肠道致病菌相似，消灭了总大肠菌群，可以认为致病肠道细菌也已消灭。针对病原微生物的一些共同特征，就选取总大肠菌群为病原微生物的指示菌之一，水中总大肠菌群含量的多寡，可在一定程度上反映水质受病原微生物污染的状况，在水质卫生学评价时具有重要意义。

应用^[4][5]

乳糖蛋白胨培养液可以用于菌落总数和大肠菌群测试片的研究与评价

对比现有广泛应用的商品化测试片,采用覆膜-载体结构制备微生物测试片,通过基础培养基配方的改良、测试片材料的选择、以及测试片结构的优化,最终制备了菌落总数和大肠菌群测试片,并对测试片的性能进行了评价。通过对不同配方培养基的性能比较,最终确定了菌落总数测试片和大肠菌群测试片所用培养基的配方。

菌落总数测试片优化后的培养基配方为:葡萄糖1.25g/L、吐温80 0.025g/L、胰蛋白胨6.25g/L、酵母粉1.25g/L;大肠菌群测试片优化后的培养基配方为:酵母粉3g/L、乳糖5g/L、氯化钠7g/L、磷酸氢二钾3.4g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨15g/L。通过对不同测试片材料的性能验证、以及不同测试片结构的比较。

最终确定了测试片的制作方法:(1)根据优化结果配制培养基,加入显色剂,搅拌均匀,加入胶凝剂,同时人工搅拌或用磁力搅拌器搅拌培养基,使得胶凝剂能在培养液中混合均匀;

(2) 将上述复配含冷水可溶胶凝剂的培养基浸渍两种无纺布3min,使无纺布浸满培养基;0.45μm的尼龙滤膜浸渍上述不含胶凝剂的培养基;由下至上依次叠放浸渍了含冷水可溶胶培养基的银河牌薄层无纺布、厚层无纺布和滤膜,叠放完成后置于55℃烘箱干燥,干燥4-6h即得到载体结构;

(3) 将3mm厚的垫圈作为下层,载体结构作为中层,4.5mm厚度的垫圈作为上层,组合制得三层“夹心”结构,即为测试片主体结构;

(4) 将测试片主体结构粘合于有粘性的底板基材上,覆盖上厚度为0.6mm的PET覆盖片材,即完成测试片的制备;

(5)按照上述方法制作的简易装置放入铝箔包装袋中。辐照灭菌,辐照剂量为15KGy。通过与国标方法比较,验证了所制备测试片的性能。结果显示,菌落总数测试片在接种实验菌种后,其检测时间为20h。在测试片精确度实验中,测试片平均符合度为103.56%,菌落检出率大于国标法。大肠菌群测试片在接种实验菌种后,其检测时间为24h。在测试片精确度实验中,测试片平均符合度为70.16%,菌落检出率小于国标法。但测试片的特异性良好,仅有大肠菌群能在测试片上生长并显色。

参考文献

[1]Evaluation of a novel dry sheet culture method(Sanita-kun R)for rapid enumeration of yeasts and molds in foods[J].Hajime Teramura;;Masashi Ushiyama;;Hirokazu Ogihara.Journal of Microbiological Methods,2015

[2]Comparison of adenosine triphosphate,microbiological load,and residual protein as indicators for assessing the cleanliness of flexible gastrointestinal endoscopes[J].Ryo Fushimi;;Masaki Takashina;;Hideki Yoshikawa;;Hiroyoshi Kobayashi;;Takashi Okubo;;Seizoh Nakata;;Mitsuo Kaku.AJIC:American Journal of Infection Control,2012

[3]A rapid method for the detection of representative coliforms in water samples:polymerase chain reaction-enzyme-linked immunosorbent assay(PCR-ELISA)[J].Jong-Tar Kuo;;Chiu-Yu Cheng;;Hsiao-Han Huang;;Chia-Fen Tsao;;Ying-Chien Chung.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,2010(3)

[4]Comparison of results of ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing methods for the determination of surface cleanliness at a hospital kitchen[J].Hasan Aycicek;;Utku Oguz;;Koray Karci.International Journal of Hygiene and Environmental Health,2005(2)

[5]徐艺芮.菌落总数和大肠菌群测试片的研究与评价[D].天津科技大学,2017.