成骨细胞分化培养基的应用

背景^[1-3]

成骨细胞分化培养基是专门为正常人类成骨细胞体外培养设计的最适于其生长的培养基。是经灭菌的液体培养基，包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清(5%)。该培养基缓冲体系为重碳酸盐，在含5%CO2的细胞培养箱中平衡后pH值为7.4。该培养基的配方能够选择性的促进正常人类微血管内皮细胞体外培养中的增殖和生长，并为其达到最理想营养平衡状态。

成骨细胞分化培养基

成骨细胞(osteoblast，OB)主要由内外骨膜和骨髓中基质内的间充质始祖细胞分化而来，能特异性分泌多种生物活性物质，调节并影响骨的形成和重建过程。

在不同成熟时期，成骨细胞在体内表现为4种不同形态，即前成骨细胞(preosteoblast)、成骨细胞(osteoblast)、骨细胞(osteocyte)和队形细胞(bonesliningcell)。前成骨细胞是成骨细胞的前体，由基质干细胞分化，沿着成骨细胞谱系发育而成，位于覆盖骨形成表面的成骨细胞的外侧。成熟的成骨细胞是位于骨表面的单层细胞，承担着合成骨基质的重要功能。

骨细胞是在成骨细胞系谱中成熟和终极的分化细胞。骨细胞包埋于矿化骨组织中，浅表骨细胞仍然保留部分成骨细胞结构。队形细胞是排列于成体大部分骨表面的一层形态扁平或呈长方形的细胞。活跃的成骨细胞为梭形、锥形或立方形，胞浆嗜碱性。细胞核位于细胞的一端，核仁明显，表面有短的突起与相邻细胞连接。电镜下胞浆内具有典型的蛋白合成结构——丰富的粗面内质网及核糖体，高尔基体较发达。

应用^[4][5]

成骨细胞分化培养基可以用于MKRN1通过增强PPARγ泛素化降解促进MC3T3-E1细胞成骨分化的研究

探索E3泛素连接酶MKRN1在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的作用,为骨质疏松类疾病的治疗提供新的方案和依据。

研究方法:1.MKRN1对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响RT-qPCR和Western Blot检测MC3T3-E1细胞成骨分化过程中MKRN1 mRNA和蛋白表达量与时间的相关性。构建腺病毒载体感染MC3T3-E1细胞过表达或敲低MKRN1,成骨分化诱导后检测ALP活性;RT-qPCR、Western Blot检测Runx2、Co L1A1、OCN的表达水平;茜素红染色检测矿化结节形成情况。

2. MKRN1和PPARγ共同作用对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响腺病毒载体感染MC3T3-E1细胞,敲低MKRN1与PPARγ的表达后诱导细胞成骨分化,检测ALP活性;RT-qPCR、Western Blot检测Runx2、Co L1A1、OCN的表达水平;茜素红染色检测矿化结节形成情况。

3. MKRN1对MC3T3-E1细胞中PPARγ表达的影响Western Blot检测过表达或敲低MKRN1对细胞内PPARγ蛋白表达水平的影响;Co-IP检测MC3T3-E1细胞内源性MKRN1和PPARγ结合情况;Co-IP检测过表达MKRN1后细胞内PPARγ蛋白的泛素化水平;Western Blot检测添加MG132后,过表达MKRN1对于细胞内PPARγ表达情况的影响。

结果:1.MC3T3-E1细胞成骨分化过程中,MKRN1 mRNA和蛋白的表达水平随着分化时间延长而升高;腺病毒载体能够稳定转染MC3T3-E1细胞,实现MKRN1过表达或敲低;敲低MKRN1表达后,与空白对照组和阴性转染组相比较,ALP活性,Runx2、COL1A1和OCN mRNA和蛋白的表达均显著降低,矿化结节形成减少(P<0.05);MKRN1过表达的MC3T3-E1细胞ALP活性,Runx2、COL1A1和OCN mRNA及蛋白表达量及矿化结节形成均高于空白对照组和空载转染组(P<0.05)。

2. 腺病毒载体能够稳定转染MC3T3-E1细胞,干扰PPARγ的表达;干扰MC3T3-E1细胞中PPARγ的表达,可以逆转MKRN1敲低后对细胞成骨分化和矿化功能的抑制作用。

3. MC3T3-E1细胞成骨分化显著降低PPARγ蛋白表达水平;敲低MKRN1表达后PPARγ蛋白表达水平升高,而过表达MKRN1降低了PPARγ蛋白表达(P<0.01);Co-IP证实了内源性MKRN1和PPARγ在细胞中具有相互作用;MKRN1过表达提高了PPARγ的泛素化水平;加入MG132逆转了过表达MKRN1对PPARγ表达的抑制作用。

结论:1.E3泛素连接酶MKRN1促进MC3T3-E1细胞的成骨向分化。2.在MC3T3-E1细胞成骨分化过程中,MKRN1通过增强PPARγ泛素化降解发挥功能。

参考文献

[1]Hyperoside Ameliorates DSS-Induced Colitis through MKRN1-Mediated Regulation of PPARγSignaling and Th17/Treg Balance.[J].Cheng Cheng;Zhang Wei;Zhang Cong;Ji Peng;Wu Xiaohui;Sha Zhou;Chen Xiang;Wang Yongkang;Chen Yugen;Cheng Haibo;Shi Liyun.Journal of agricultural and food chemistry,2021

[2]Exercise Effects on Bone Mineral Density in Men[J].Mages Michelle;Shojaa Mahdieh;Kohl Matthias;von Stengel Simon;Becker Clemens;Gosch Markus;Jakob Franz;KerschanSchindl Katharina;Kladny Bernd;Kl?ckner Nicole;Lange Uwe;Middeldorf Stefan;Peters Stefan;Schoene Daniel;Sieber Cornel C.;Tholen Reina;Thomasius Friederike E.;Uder Michael;Kemmler Wolfgang.Nutrients,2021(12)

[3]PPARβ/δaccelerates bone regeneration in diabetic mellitus by enhancing AMPK/mTOR pathway-mediated autophagy[J].Chen Miao;Jing Dian;Ye Rui;Yi Jianru;Zhao Zhihe.Stem Cell Research&Therapy,2021(1)

[4]Sonic hedgehog signals hinder the transcriptional network necessary for pancreatic endoderm formation from human embryonic stem cells[J].Dumasia Niloufer P.;Khanna Aparna P.;Pethe Prasad S..Genes to Cells,2021(5)

[5]刘敬东.MKRN1通过增强PPARγ泛素化降解促进MC3T3-E1细胞成骨分化的研究[D].中国医科大学,2022.