多酶级联高效合成L-2-氨基丁酸

L-2-氨基丁酸是一种非天然手性氨基酸，用于抑制人类神经信息的传递，促进脑细胞代谢，因此被广泛用作手性药物的前体。它可以通过酰胺化制备 (S)-2-抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦的关键前体——氨基丁酰胺；也可以通过还原L-2-氨基丁酸制备抗结核药物乙胺丁醇的关键手性中间体——(S)-2-氨基丁醇。

目前，L-2-氨基丁酸主要是通过化学法或生物法制备。传统的化学制备因成本高、能耗高、污染严重、光学纯度低等缺点失去了竞争力。因此，生物制备已成为当今的研究热点。近些年来，以L-苏氨酸为底物，苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶一锅法转化制备L-2-氨基丁酸，收率为97.3%。然而，上述方法需要构建两种单基因单独表达或双基因共表达的生物催化剂，并严格配比不同重组酶所需添加的酶量、操作烦琐，增加了生产成本和工艺要求。因此，亟需构建多酶级联催化的单细胞以实现同一宿主的多酶共表达。因此，理性设计改造亮氨酸脱氢酶提高其催化活性、构建多酶级联催化的单细胞是本研究的重点。

本研究将来源于西伯利亚杆菌的亮氨酸脱氢酶与底物2-酮丁酸对接，利用分子动力学模拟软件计算分析，发现该酶的均方根涨落 （RMSF）值在361–373位氨基酸之间有剧烈波动，因此对该Loop区域合理设计、适当截短该区域的长度，获得了一株比酶活及稳定性均得到改善的突变株，并将其运用至L-2-氨基丁酸的生物制备中；此外，由于苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸速率过快导致2-酮丁酸积累，同时甲酸脱氢酶提供再生的辅因子NADH不能满足反应的需要，使得多酶催化不平衡，因此双拷贝亮氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶以平衡多酶催化速率，构建多酶级联催化的单细胞E. coli BL21/pACYCDuet-RM (图1)。 

图1  多酶级联表达制备l-2-氨基丁酸的示意图

科学发现一

截短Loop处的氨基酸可以大幅影响酶活力，而且364–374位氨基酸的截短则显著提高了比酶活。

科学发现二

使用GROMACS进行分子动力学模拟。RMSD结果表明突变体的结构更稳定；回旋半径Rg显著降低表明截短后蛋白构象的紧密性更好。推测C端Loop区域的截短导致底物进入结合通道的空间变大，底物更易结合导致酶活提高。通过MMPBSA方法计算了底物与蛋白之间的结合自由能，野生型体系的结合自由能为−3.45 kcal/mol，突变后体系的结合自由能为−6.28 kcal/mol，充分显示了突变后的蛋白与底物的结合更强。

科学发现三

菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM具有明显的优越性，摩尔转化率相较于E. coli BL21/pACYCDuet-RO、E. coli BL21/ pACYCDuet-RT各提高了74.6%、39%。

科学发现四

最适转化条件为pH7.5、温度35℃、最适底物浓度80 g/L，此时重组菌E. coli/ pACYCDuet-RM产量达到值66.4 g/L，产率接近100%。

科学发现五

5 L发酵罐发酵培养、最适条件下转化，120 g L-苏氨酸制备获得97.9 g L-2-氨基丁酸，其摩尔转化率为96%，且底物转化率大于99% (图2)。

图2  5 L发酵罐全细胞转化制备l-2-ABA