PKCα抗体(兔单抗)

背景^[1][2][3][4]

PKCα抗体(兔单抗)中蛋白激酶C的α（PKCα）是一种酶，在人中由编码PRKCA基因。蛋白激酶C（PKC）是丝氨酸和苏氨酸特异性蛋白激酶家族，其可被钙和第二信使二酰基甘油激活。PKC家族成员磷酸化多种蛋白质靶标，并且已知其参与多种细胞信号传导途径。PKC家族成员也是佛波醇酯的主要受体，一类肿瘤促进剂。PKC家族的每个成员具有特定的表达谱，并且被认为在细胞中发挥独特的作用。该基因编码的蛋白质是PKC家族成员之一。

据报道，该激酶在许多不同的细胞过程中发挥作用，例如细胞粘附，细胞转化，细胞周期检查点和细胞体积控制。小鼠的敲除研究表明，这种激酶可能是心肌收缩力和肌细胞内Ca 2+处理的基本调节因子。蛋白激酶C-α（PKC-α）是蛋白激酶家族的特定成员。这些酶的特征在于它们能够将磷酸基团添加到其他蛋白质中，从而改变它们的功能。PKC-α已在许多生物的组织中广泛研究，包括果蝇，爪蟾，牛，狗，鸡，人，猴，小鼠，猪和兔。目前正在进行许多研究，研究该酶的结构，功能和调节。关于该酶的最新研究包括其一般调节，肝功能和心脏功能。

与该家族中的其他激酶相比，PKC-α在其调节模式中是独特的。通常，蛋白激酶家族受变构调节的调节，调节分子的结合影响酶的构象变化，从而改变酶的活性。然而，PKC-α调节的主要模式涉及其与细胞膜的相互作用，而不是与特定分子的直接相互作用。细胞膜由磷脂组成。在较温暖的温度下，由于分子内运动增加，磷脂以更流动的状态存在。细胞膜越流畅，PKC-α的活性越大。在较低温度下，发现磷脂处于固态并具有收缩运动。随着磷脂变得静止，它们在膜内呈现特定的取向。相对于膜以不规则或成角度取向固化的磷脂可降低PKC-α的活性。

细胞膜的组成也可以影响PKC-α的功能。钙离子，镁离子和二酰基甘油（DAG）的存在是最重要的，因为它们影响膜的疏水结构域。这三种组分的不同浓度构成疏水结构域的更长或更短的长度。具有长疏水结构域的膜导致活性降低，因为PKC-α更难以插入膜中。在低浓度下，疏水结构域较短，使PKC-α易于插入膜中并且其活性增加。PKCα活化的增加与癌症的生长和侵袭有关。高水平的PKCα与恶性脑癌有关。此外，胶质瘤肿瘤细胞的高增殖率是同工酶PKCα过表达的结果。PKCα抗体(兔单抗)是将PKCα蛋白注入兔体内进行免疫程序，再提取兔血中的抗体最后再进行层析纯化。

研究应用^[5]

PKCα抗体(兔单抗)可用于PKCα-Nrf2-HO-1信号通路在兔内毒素休克急性肺损伤中作用的研究。研究方法血红素氧合酶-1(HO-1)被认为是对抗氧化应激、炎性刺激等适应性的细胞反应,HO-1代谢产物中的胆红素具有强大抗炎、抗氧化性,有肺脏保护作用,但是有关诱导HO-1表达上调的机制尚不清楚,因此明确其诱导表达机制,对内毒素休克肺损伤的防治具有十分重要的指导意义。

转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)具有抗炎、抗氧化,抑制细胞凋亡等多重生物活性,Nrf2是一种重要转录因子,在提供细胞保护、维系细胞生存方面具有重要意义,属于基本亮氨酸拉链的一个子集,其广泛存在于机体组织细胞中。与抗氧化反应序列元件(ARE)共同构成Keapl-Nrf2/ARE通路;而蛋白激酶C(PKC)为苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶,是一种磷脂、Ca2+所依赖的蛋白激酶,参与细胞的分化、增殖、凋亡、迁移、细胞支架组构等,并承担着跨膜信号传递等重要作用,其机制是诱导了多种蛋白质上的Thr/Ser磷酸化。

PKC信号转导通路是高度保守三级激酶级联传递信号通路,发生低血压性休克时,启动该通路,可减少血液动力学的大幅波动,维持生命体征相对平稳。PKCα属传统或者说是典型的PKC(classicalor conventional PKC,CPKC),隶属于A组中一个亚类,其激活的标志通常认为就是PKCα发生了转位。它可以活化Nrf2,促使其移入细胞核,从而发挥上调HO-1表达的作用。

目前,关于PKCα-Nrf2-HO-1在内毒素休克急性肺损伤作用的研究尚未见相关报道。本研究拟通过建立内毒素休克肺损伤模型并应用相关通路阻断剂及诱导剂来评价PKCα-Nrf2-HO-1通路在兔内毒素休克急性肺损伤中的作用,为日后相关研究提供理论依据。目的本研究拟探讨PKCα-Nrf2-HO-1通路在兔内毒素休克诱发急性肺损伤中的作用。

方法健康清洁级新西兰大白兔70只,雌雄不拘,2月龄,体重2.0~2.5 kg,采用随机数字表法,随机分为7组(n=10):空白对照组(C组)、模型组(M组)、PKC阻断剂白屈菜赤碱+模型组(CHE+M组)、PKC诱导剂豆蔻酸佛波酰乙酯+模型组(PMA+M组)、PKC阻断剂白屈菜赤碱组(CHE组)和PKC诱导剂豆蔻酸佛波酰乙酯组(PMA组)、溶媒二甲亚砜组(DMSO组)。

CHE+M组、CHE组腹腔注射白屈菜赤碱(Chelerythrine,CHE)8mg/kg(溶于0.5ml DMSO),PMA+M和PMA组腹腔注射豆蔻酸佛波酰乙酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)0.02 mg/kg(溶于0.5ml DMSO),C组腹腔注射生理盐水0.5ml,其余各组以同样方式注射DMSO 0.5 ml。M组、CHE+M组和PMA+M组30min后耳缘静脉注射LPS 5 mg/kg(溶于2 ml生理盐水)制备内毒素休克急性肺损伤模型,其余各组注射生理盐水2ml。

耳缘静脉注射LPS后两小时后,右颈总动脉置管所监测的各组平均动脉压变化至原始值的75%及以下,即可认为模型建立成功。在脂多糖注射到达6小时后处死各组的实验兔,采集右颈总动脉血样3.5 ml并取肺组织。留取肺组织行病理学观察并进行病理评分,测定肺组织W/D比率、SOD活性及MDA含量,检测血清TNF-α和IL-10浓度以及肺组织Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白、PKCα蛋白、HO-1蛋白的表达。

结果与C组比较,M组、PMA+M组和CHE+M组肺组织病理学评分、TNF-α和IL-10浓度、W/D比率、MDA含量升高,Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的表达上调,SOD活性降低(P均<0.05);M组和PMA+M组PKCα蛋白水平表达上调(P<0.05),CHE+M组则差异无统计学意义(P>0.05);CHE组、PMA组、DMSO组上述各指标差异无统计学意义(P>0.05)。

与M组比较,CHE+M组肺组织病理学评分、TNF-α浓度、W/D比率、MDA含量升高,Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白、PKCα蛋白及HO-1蛋白的表达下调(P<0.05),IL-10浓度、SOD活性降低(P<0.05);PMA+M组肺组织病理学评分、TNF-α浓度、W/D比率、MDA含量降低,Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白、PKCα蛋白及HO-1蛋白的表达上调(P<0.05),IL-10浓度、SOD活性升高(P<0.05)。

与CHE+M组比较,PMA+M组肺组织病理学评分、TNF-α浓度、W/D比率、MDA含量降低,Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2总蛋白、Nrf2核蛋白、PKCα蛋白及HO-1蛋白的表达上调(P<0.05),IL-10浓度、SOD活性升高(P<0.05)。结论PKCα-Nrf2-HO-1通路减轻了兔内毒素休克诱发急性肺损伤,机制可能与肺组织HO-1表达上调有关。

参考文献

[1] Micol V, Sánchez-Piñera P, Villalaín J, de Godos A, Gómez-Fernández JC (Feb 1999). "Correlation between protein kinase C alpha activity and membrane phase behavior". Biophysical Journal. 76 (2): 916–27. doi:10.1016/S0006-3495(99)77255-3. PMC 1300093. PMID 9929493.

[2] Yazaki T, Ahmad S, Chahlavi A, Zylber-Katz E, Dean NM, Rabkin SD, Martuza RL, Glazer RI (Aug 1996). "Treatment of glioblastoma U-87 by systemic administration of an antisense protein kinase C-alpha phosphorothioate oligodeoxynucleotide". Molecular Pharmacology. 50 (2): 236–42. PMID 8700129.

[3]  Baltuch GH, Dooley NP, Rostworowski KM, Villemure JG, Yong VW (1995). "Protein kinase C isoform alpha overexpression in C6 glioma cells and its role in cell proliferation". Journal of Neuro-Oncology. 24 (3): 241–50. doi:10.1007/BF01052840. PMID 7595754.

[4]  Storz P, Hausser A, Link G, Dedio J, Ghebrehiwet B, Pfizenmaier K, Johannes FJ (Aug 2000). "Protein kinase C [micro] is regulated by the multifunctional chaperon protein p32". The Journal of Biological Chemistry. 275 (32): 24601–7. doi:10.1074/jbc.M002964200. PMID 10831594.

[5] PKCα-Nrf2-HO-1信号通路在兔内毒素休克急性肺损伤中的作用[D]. 刘国艳.天津医科大学 . 2015