泛素化组蛋白H2AX抗体的应用

背景^[1-3]

泛素化组蛋白H2AX抗体是一类可以特异性结合泛素化组蛋白H2AX的多克隆抗体，主要用于体外检测泛素化组蛋白H2AX的免疫学实验。

泛素是一种在真核生物中普遍分布且高度保守的小的调节蛋白，它与包括蛋白质降解、应激反应、细胞周期调控、蛋白质运输、内吞信号传导和转录调控在内的多种细胞过程相关。通过酶的作用，将泛素添加至底物蛋白的过程称为蛋白质的泛素化。组蛋白泛素化是组蛋白翻译后修饰中的一种。组蛋白H2A是个被鉴定为泛素化的组蛋白，在高等真核生物中，约有5-15%的H2A在高度保守的K119位被单泛素化修饰（ubH2A）。除了H2A，H2B也被泛素化，但丰富程度较低（1-2%）。此外，也有报道H3和H1的泛素化，但没有H2A和H2B普遍。作为一种重要的组蛋白翻译后修饰，组蛋白泛素化在核小体结构的动态调控中发挥至关重要的作用，它还参与细胞的DNA损伤反应以及抑制转录。

泛素化组蛋白H2AX抗体

细胞通过DNA损伤应答感应并修复受损的DNA，进而维持基因组稳定性。在DNA双链断裂引起的DDR中，组蛋白H2A及其变体H2AX的泛素化修饰对于下游损伤修复蛋白的招募至关重要。

在DNA双链断裂发生时，RPL6被募集至DNA损伤位点，其与H2A的相互作用随之增强，这一过程依赖于ADP核糖基化聚合酶PARP。RPL6通过增强MDC1与γH2AX间的相互作用促进MDC1在DNA损伤位点的累积，MDC1进一步招募泛素连接酶RNF8和RNF168催化组蛋白H2A于13，15位赖氨酸发生泛素化修饰，泛素化的H2A随后启动对修复蛋白53BP1和BRCA1的招募。RPL6的敲低导致了G2-M检验点的失活，非同源末端连接和同源重组修复效率的降低，以及细胞在依托泊苷处理后存活能力的下降。

应用^[4][5]

泛素化组蛋白H2AX抗体可以用于高糖诱导的肾系膜细胞组蛋白H2A、H2B泛素化表达及作用研究

将肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)作为研究对象,对高糖刺激后大鼠肾小球系膜细胞内组蛋白H2A 119位赖氨酸残基(K119)、H2B 120位赖氨酸残基(K120)泛素化表达及泛素化的组蛋白H2A、H2B(uH2A、uH2B)和TGF-βmRNA表达进行研究,旨在探讨uH2A、uH2B在糖尿病肾病发病中的潜在机制及作用。

方法:1、细胞培养及分组:培养大鼠肾小球系膜细胞,以高糖作为刺激因子,泛素蛋白酶体抑制剂MG132作为泛素化阻断剂,实验分为六组:①正常对照组(NC组):培养基含5.6 mmol/L葡萄糖;②10 mmol/L高糖组(HG1组):培养基含10 mmol/L葡萄糖;③20 mmol/L高糖组(HG2组):培养基含20 mmol/L葡萄糖;④30 mmol/L高糖组(HG3组):培养基含30 mmol/L葡萄糖;⑤渗透压对照组(甘露醇组):培养基含5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇;⑥MG132干预组(MI组):培养基含30 mmol/L葡萄糖+1μmol/L MG132。

2、各组细胞分别培养12h、24h、48h后,用蛋白免疫印迹(Western-blot)、细胞免疫荧光染色法及激光共聚焦显微镜检测各组细胞uH2A、uH2B表达;用RT-PCR检测各组细胞uH2A、uH2B及TGF-βmRNA表达。

3、统计学分析:应用SPSS11.5统计软件分析数据。数据均以均数±标准差(x±s)表示,各组间比较用单因素方差分析,两两比较采用q检验,检验水准α=0.05,P<0.05表示有统计学意义。

结果1、大鼠肾小球系膜细胞内uH2A表达:正常组(NC组)泛素化的H2A表达较低,各高糖组H2A泛素化较NC组增加(P<0.01),呈浓度依赖性,以HG3组24h时H2A泛素化表达最强。与HG3组比较,加入泛素蛋白酶体抑制剂MG132可阻止高糖诱导的H2A泛素化(P<0.05);甘露醉组H2A泛素化与NC组无差异(P>0.05);

2、大鼠肾小球系膜细胞内uH2B表达:正常组(NC组)泛素化的H2B表达较强。与NC组比较,HG1组H2B泛素化变化无明显差异(P=0.327),HG2、HG3组H2B泛素化较NC组减少(P<0.01),以HG3组48h时H2B泛素化表达最弱。与HG3组比较,MI组H2B泛素化增加(P<0.05);甘露醇组H2B泛素化与NC组无差异(P>0.05);

3、大鼠肾小球系膜细胞内uH2A、uH2B及TGF-βmRNA表达:与NC组比较,HG3组和MI组uH2A、uH2BmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05);HG3组TGF-βmRNA表达较NC组增加(P<0.05),MI组TGF-βmRNA表达较HG3组减少(P<0.05)。

参考文献

[1]Proteasome inhibitor MG132 induces selective apoptosis in glioblastoma cells through inhibition of PI3K/Akt and NFkappaB pathways,mitochondrial dysfunction,and activation of p38-JNK1/2 signaling[J].Alfeu Zanotto-Filho;;Elizandra Braganhol;;Ana Maria Oliveira Battastini;;JoséCláudio Fonseca Moreira.Investigational New Drugs,2012(6)

[2]Proteasome inhibition-induced p38 MAPK/ERK signaling regulates autophagy and apoptosis through the dual phosphorylation of glycogen synthase kinase 3β[J].Cheol-Hee Choi;;Byung-Hoon Lee;;Sang-Gun Ahn;;Seon-Hee Oh.Biochemical and Biophysical Research Communications,2012(4)

[3]Apoptosis inducer NGFI-B is degraded by the proteasome and stabilized by treatment with EGF[J]..Biochemical and Biophysical Research Communications,2012(4)

[4]Cytokines in diabetic nephropathy[J].Chia-Chao Wu;;Huey-Kang Sytwu;;Yuh-Feng Lin.Advances in Clinical Chemistry,2012

[5]高陈林.高糖诱导的肾系膜细胞组蛋白H2A、H2B泛素化表达及作用研究[D].泸州医学院,2012.