MG-132 (Proteasome抑制剂)

背景^{[1][2][3][4][5]}

MG-132 (Proteasome抑制剂)是一种有效的，可逆的，可透过细胞的蛋白酶体抑制剂（Ki=4 nM）。N-苄氧基羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酸MG132属于合成肽醛类抑制剂。它通过26S复合物降低哺乳动物细胞和酵母可渗透菌株中泛素-共轭蛋白的降解，而不影响其ATP酶或肽酶活性。MG132激活c-Jun N-末端激酶（JNK1），其启动细胞凋亡。

MG132还以3μM的IC 50抑制NF-κB活化，并阻断β-分泌酶活性。在具有约50μMMG132的IC 50的HeLa细胞中观察到剂量依赖性的细胞生长抑制24小时。MG132通过诱导细胞周期停滞以及引发细胞凋亡来抑制HeLa细胞的生长。MG-132以时间和剂量依赖性方式抑制C6神经胶质瘤细胞增殖（24小时时IC 50值为18.5μM）。MG-132（18.5μM）在3小时时抑制蛋白酶体活性约70％。

MG-132通过下调抗细胞凋亡蛋白Bcl-2和XIAP，促凋亡蛋白Bax和半胱天冬酶-3的上调以及切割的C端85kDa PARP的产生来诱导细胞凋亡。MG-132还会使活性氧增加5倍以上。IC 50MG-132对孵育48小时后对HeLa，CaSki和C33A宫颈癌细胞存活率的影响分别为2.1,3.2和5.2μM。使用sc异种移植模型检查MG-132对宫颈癌的体内抗肿瘤活性。

使用以下方案以1mg/kg注射MG-132：对于携带HeLa肿瘤的小鼠，第1,4,8,12,15,18,23和26天。与对照相比，MG132的生长抑制率为49％。MG-132（ip，0.1 mg/kg/day）通过调节ERK1/2和JNK1信号通路，减轻压力超负荷引起的心脏肥大，改善腹主动脉条带（AAB）大鼠的心脏功能。

研究应用^[6]

MG-132 (Proteasome抑制剂)可用于诱导肝癌细胞凋亡和自噬的机制研究。研究方法蛋白酶体抑制剂（proteasome inhibitors,PIs）可以通过抑制肿瘤细胞的周期,阻止其无限增殖,PIs尤其可以选择恶性程度高的肿瘤细胞首先发挥毒性作用。因此,选择PIs治疗HCC是有希望的。MG132是PIs中的一种,更是一种天然的PIs。并且,已经证明MG132能够对HCC细胞发挥毒性作用。

MG132对HCC细胞的毒性作用涉及多种途径,如p53、MAPK和AKT,以及多种基因如TRAIL等。但是MG132在治疗HCC细胞中的更加全面的调控机制并不是很清楚。为了MG132能够更早更好的应用临床治疗HCC,对MG132治疗HCC的调控机制进行更加深入全面的探讨是有必要的。SIRT2是一种去乙酰化酶,与一些E3泛素连接酶具有相互作用。

SIRT2参与细胞的有丝分裂,通过细胞周期影响细胞的增殖。并且,SIRT2在HCC组织和细胞中高表达,与HCC的恶性程度呈正相关。有证据证明,慢病毒介导的SIRT2沉默能够抑制HCC细胞的增殖,说明SIRT2的下调将有助于HCC的治疗。但是,在使用MG132治疗HCC的过程中是否能够引起SIRT2下调,并没有研究。因此,为了全面地了解MG132在治疗HCC过程中的功能,在HCC细胞中展开对MG132和SIRT2的研究是有必要的。

目的本研究通过初步探讨MG132在抑制SMMC-7721细胞的增殖,诱导SMMC-7721细胞的凋亡和自噬的调控机制,旨在阐明SIRT2在MG132处理SMMC-7721细胞过程中的作用。并且通过对MG132抑制SMMC-7721细胞增殖过程中机制的研究,为MG132治疗HCC提供更多的理论依据,最终将有助于治疗HCC新药物的开发。

方法：
1.选取HCC细胞株SMMC-7721细胞做为研究对象,用MTT检测2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM和80μM浓度的MG132培养SMMC-7721细胞24 h的细胞活力。
2.用20μM的MG132培养SMMC-7721细胞24 h,用hoechst33258染色检测是否有凋亡小体;western blot检测凋亡相关蛋白cleaved-caspase3的变化;用MDC染色检测自噬小体;western blot检测自噬蛋白LC3I和LC3II的变化。
3.选取20μM MG132培养SMMC-7721细胞6 h、12 h和24 h,用western blot检测SIRT2、LC3I、LC3II、ATG7、STAT3和P-STAT3的变化。
4.SIRT2转染SMMC-7721细胞。
5.20μM MG132培养正常、转染PCDNA3.1-HA质粒和转染SIRT2-PCDNA3.1-HA质粒的SMMC-7721细胞株6 h、12 h、18 h和24 h,用MTT检测细胞的抑制率。
6.20μM MG132培养转染PCDNA3.1-HA质粒和转染SIRT2-PCDNA3.1-HA质粒的SMMC-7721细胞株24 h,用western blot检测LC3I和LC3II的变化;用MDC染色比较两种细胞自噬程度的差异;用细胞凋亡流式和hoechst33258染色比较两种细胞凋亡程度的差异。

结果：
1.MTT结果表明,随着MG132浓度和时间的增加SMMC-7721细胞的增殖受到明显的抑制。
2.MDC和hoechst33258染色以及western blot结果看出,使用20μM MG132处理SMMC-7721细胞24 h,与对照组相比MG132处理组细胞出现了的凋亡和自噬特征。
3.选择20μM MG132培养正常SMMC-7721细胞6 h、12 h和24 h,SIRT2的蛋白表达水平在12 h和24 h出现了明显的下调;同时自噬相关蛋白ATG7表达上调和标志性蛋白LC3II表达上调;同时检测到P-STAT3下调。
4.选择20μM MG132培养细胞24 h,MTT检测到正常细胞株和转染PCDNA3.1-HA质粒细胞株的抑制率高于转染SIRT2-PCDNA3.1-HA质粒细胞株。
5.选择20μM MG132培养SMMC-7721细胞24 h后,western blot、MDC染色、细胞凋亡流式和hoechst33258染色的结果显示,转染PCDNA3.1-HA质粒细胞株和自噬特征比转染SIRT2-PCDNA3.1-HA质粒细胞株凋亡现象更加显著。

结论:
1.MG132能够抑制SMMC-7721细胞增殖,诱导SMMC-7721细胞凋亡和自噬。
2.MG132通过下调SIRT2抑制SMMC-7721细胞增殖,诱导细胞的凋亡和自噬。

参考文献

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[6] MG132诱导肝癌细胞凋亡和自噬的机制研究[D].刘红岩.河南大学.2018