细胞侵袭的应用

背景^[1-3]

细胞侵袭叫做细胞爬行，细胞移动或者细胞运动，是细胞在化学信号（如：趋化因子）的驱使下沿着浓度梯度从一个区域转移到另一区域的运动，是活细胞普遍存在的一种运动形式。细胞迁移在损伤修复，细胞分化，胚胎发育，肿瘤转移等生理病理过程中普遍存在。

细胞侵袭与细胞迁移比较类似，但是“侵袭”需要细胞穿过胞外基质层（ECM）或基底膜基质层（BME），在这个过程中细胞先酶解去除ECM/BME的阻碍，从而在趋化因子浓度梯度的驱使下完成从一处到另一处的移动。常用来评估肿瘤细胞在正常组织中转移的能力，但正常细胞，如巨噬细胞也有相同的能力。

细胞侵袭

细胞体外侵袭实验主要应用于各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响及一些抑制血管生成的新药研究。Transwell侵袭实验是检测肿瘤细胞侵袭能力最常用的实验方法，其原理是用一层聚碳酸酯膜将高营养的培养液和低营养的培养液隔开，细胞接种到低营养的培养液里，通常膜孔都被Matrigel覆盖，模仿细胞外基质，肿瘤细胞必须分泌水解酶并通过变形运动才能穿过铺有Matrigel的滤膜，计数进入下室的细胞量可反应肿瘤细胞的侵袭能力。

细胞侵袭实验：

1、ECM Gel原液提前1h放在4℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。

2、将1.5 mL EP管、枪头和细胞小室（已先行放入孔板中），置于冰上预冷。

3、根据自己的使用量，按照ECM Gel:无血清培养基=1:7.5在冰上稀释成使用液。

4、把枪头剪去一小段（约3µm）后在冰上吸取40µL/孔ECM Gel使用液轻轻加入小室的上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。

5、放在37℃孵箱15min，让胶凝固。

6、消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104/mL用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。

7、按照每孔200µL，将细胞悬液加入上室，同时在下室加入10%FBS+培养基500µL，放入37℃孵箱培养。

8、若干小时后取出，吸去上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。

9、在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。

10、在正置显微镜上放置一块载玻片，将细胞小室倒置放在上面，拍照。

11、在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。

应用^[4][5]

细胞侵袭可以用于TAB182通过EGFR信号通路调控人肺癌细胞EMT及侵袭迁移

通过构建TAB182低表达人肺癌细胞株,开展以下三项工作:(1)探究TAB182对DNA损伤应答蛋白的表达调控;(2)探究TAB182对肺癌细胞EGFR的作用及机制;(3)阐明TAB182通过EGFR信号通路调控肺癌细胞EMT及侵袭迁移。

方法:(1)建立shRNA介导的TAB182稳定敲低肺癌细胞株:用慢病毒颗粒感染A549和H1299肺癌细胞后,先用荧光显微镜观察GFP信号以验证感染效率,然后验证TAB182 mRNA及蛋白敲降效果。其中,Control-shRNA为TAB182正常表达细胞(下称对照细胞),TAB182-shRNA#1和TAB182-shRNA#2为TAB182敲降细胞。

(2) 验证TAB182参与DNA双链断裂损伤修复:用4Gy 60Coγ射线单次照射A549-TAB182低表达细胞株(下文默认照射方式为60Coγ射线单次照射),在照后0 h、1 h、2 h和4 h检测DNA双链断裂标志物γ-H2AX水平变化;验证HUWE1-shRNA敲低表达的Hela细胞株的HUWE1敲降效率,并在10Gy照后24 h内观察γ-H2AX焦点数量变化。

(3) 探究TAB182对DNA损伤应答蛋白的表达影响:分析A549和H1299-TAB182低表达细胞株中ATM、DNA-PKcs、Ku86、Ku70、Ct IP、EGFR、p21和p16蛋白水平改变。

(4) 探究TAB182对肺癌细胞EGFR信号的影响:分析A549-TAB182低表达细胞株中EGFR mRNA及蛋白水平。

(5) 探究TAB182对肺癌细胞EMT标志蛋白的表达影响:检测A549-TAB182低表达细胞株中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、Snail蛋白水平变化。

(6) 验证EGFR过表质粒效果:将EGFR过表质粒转入普通A549细胞中24 h后,分析EGFR、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和α-SMA表达变化。

(7) 探究EGFR是否介导TAB182调节肺癌细胞EMT:将EGFR过表质粒转入A549-TAB182低表达细胞株后24 h,检测EGFR、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和MMP-2表达改变。

(8) 验证EGFR蛋白的放射响应性:在4Gy照射普通A549细胞后1d和4 d,分析EGFR表达改变。

(9) 探究放射应答蛋白EGFR的剂量依赖性:在0.5、1、2、4、6、8、10Gy照射普通A549细胞后第7 d,检测EGFR表达变化。

(10) 验证TAB182蛋白的放射响应性:在4Gy照射A549-TAB182低表达细胞株后第3 d,分析TAB182表达改变。

(11) 在照射条件下探究TAB182对肺癌细胞EGFR信号及EMT表型的影响:在4Gy照射A549-TAB182低表达细胞株后0 h、24 h、48 h和7 d,检测EGFR及EMT分子标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达变化。

(12) 探究TAB182是否影响放射致肺癌细胞侵袭活性增强:在4Gy照射A549-TAB182低表达细胞株后第7 d,通过Transwell侵袭实验评价细胞侵袭活性。

(13) 探究TAB182对肺癌细胞EGFR蛋白稳定性的影响:在10μg/m L放线菌酮(CHX)处理A549-TAB182低表达细胞株后0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24h,通过Western Blotting分析EGFR蛋白水平下降速率;为了在照射条件下研究EGFR稳定性,先用CHX预处理A549-TAB182低表达细胞株,然后在4Gy照后不同时间点分析EGFR蛋白水平变化。

(14) 探究TAB182对各类肺癌细胞表型的影响:在A549-TAB182低表达细胞株中,通过CCK-8活力实验检测细胞增殖活性;通过克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;通过划痕实验检测细胞迁移能力;通过Transwell侵袭实验评价体外侵袭活性。

(15) 探究EGFR是否介导TAB182调节肺癌细胞侵袭迁移:将EGFR过表质粒转入TAB182敲降肺癌细胞后24 h,通过Transwell迁移/侵袭实验评价细胞侵袭及迁移活性。

参考文献

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[2]Ionizing radiation induces epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells.[J].Tang Bo;;Xi Yue;;Cui Fengmei;;Gao Jin;;Chen Huiqin;;Yu Wentao;;Tu Yu.Bioscience reports,2020(8)

[3]TRIB3-EGFR interaction promotes lung cancer progression and defines a therapeutic target.[J].Yu Jiao-Jiao;;Zhou Dan-Dan;;Yang Xiao-Xiao;;Cui Bing;;Tan Feng-Wei;;Wang Junjian;;Li Ke;;Shang Shuang;;Zhang Cheng;;Lv Xiao-Xi;;Zhang Xiao-Wei;;Liu Shan-Shan;;Yu Jin-Mei;;Wang Feng;;Huang Bo;;Hua Fang;;Hu Zhuo-Wei.Nature communications,2020(1)

[4]HUWE1-dependent DNA-PKcs neddylation modulates its autophosphorylation in DNA damage response.[J].Guo Zongpei;;Wang Shaozheng;;Xie Ying;;Han Yang;;Hu Sai;;Guan Hua;;Xie Dafei;;Bai Chenjun;;Liu Xiaodan;;Gu Yongqing;;Zhou Ping-Kun;;Ma Teng.Cell death&disease,2020(5)

[5]王少正.TAB182通过EGFR信号通路调控人肺癌细胞EMT及侵袭迁移[D].军事科学院,2022.