人免疫球蛋白G FC片段(FCΓ)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人免疫球蛋白G FC片段(FCΓ)ELISA KIT用于检测血液、血清、胸腹水等其他体液中免疫球蛋白G FC片段(FCΓ)的含量。

实验原理：人免疫球蛋白G FC片段(FCΓ)ELISA KIT是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被免疫球蛋白G FC片段(FCΓ)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的免疫球蛋白G FC片段(FCΓ)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人免疫球蛋白G FC片段(FCΓ)ELISA KIT

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

人免疫球蛋白G FC片段(FCΓ)ELISA KIT用于人免疫球蛋白G的Fab和Fc片段制备及层析分离研究

人免疫球蛋白G（hIgG）在木瓜蛋白酶的作用下降解为Fab片段和Fc片段,相较于完整的抗体,抗体片段在生理和临床上有许多独特的意义。此外,探讨不同抗体片断与层析介质间的相互作用,也能为抗体分离纯化优化和新型配基设计提供实验依据。

从抗体片段的制备入手,研究不同混合模式层析介质对抗体片段的吸附情况,探讨抗体片段分离纯化新方法。主要结果如下：首先优化了木瓜蛋白酶降解血清来源人免疫球蛋白G的酶解条件,并制备了Fab和Fc片段。通过调节酶解反应pH、酶加入量、半胱氨酸加入量以及酶解反应时间等,优化酶解反应过程,得到Fab和Fc片段含量较高的酶解液。酶解优化条件为：101ng/ml hIgG、0.5mg/ml木瓜蛋白酶、10mmM半胱氨酸、2rnM EDTA,pH7.6,酶解时间4h,hIgG的酶解转化率达到98%以上,并且杂片段含量较少。酶解液通过Protein A亲和层析和DEAE阴离子交换层析两步法纯化,得到Fab片段纯度96.6%,收率为40.1%,Fc片段纯度95.7%,收率为72.6%。

利用自制的抗体Fab片段和Fc片段,考察了MEP HyperCel、Capto adhere和Toyopearl MX-Trp-650M三种混合模式层析介质对抗体片段的吸附情况,发现阴子离交换型混合模式介质Capto adhere对两种片段有一定的选择性,在pH7-pH8附近对Fc片段的吸附能力要显著强于Fab片段。MEP HyperCel介质和Toyopearl MX-Trp-650M介质对两种片段的吸附在不同pH下差异均不大。

结合优化的酶解条件以及混合模式层析对Fab片段和Fc片段的吸附差异,选用Capto adhere介质,在pH7.5下对酶解液进行层析分离,并通过Protein A亲和层析检测组分含量。

发现Fc片段几乎完全被Capto adhere介质捕获,穿透峰仅含Fab片段,实现了抗体片段的有效分离。

优化了木瓜蛋白酶酶解人免疫球蛋白G的酶解条件,采用Protein A亲和层析和DEAE阴离子交换层析两步法制备了较高纯度的Fab片段和Fc片段,考察了混合模式层析介质对两种片段的吸附差异,并实现了混合模式层析分离抗体片段。

参考文献

[1]Technology trends in antibody purification[J].Pete Gagnon.Journal of Chromatography A.2011

[2]Antibody capture by mixed-mode chromatography:A comprehensive study from determination of optimal purification conditions to identification of contaminating host cell proteins[J].Jerome Pezzini,Gilles Joucla,RenéGantier,Magali Toueille,Anne-Marie Lomenech,Caroline Le Sénéchal,Bertrand Garbay,Xavier Santarelli,Charlotte Cabanne.Journal of Chromatography A.2011(45)

[3]Membrane bioreactor separator system for integrated IgG fragmentation and Fab purification[J].Deqiang Yu,Raja Ghosh.Journal of Immunological Methods.2010(1)

[4]Two routes for production and purification of Fab fragments in biopharmaceutical discovery research:Papain digestion of mAb and transient expression in mammalian cells[J].Yonghong Zhao,Lester Gutshall,Haiyan Jiang,Audrey Baker,Eric Beil,Galina Obmolova,Jill Carton,Susann Taudte,Bernard Amegadzie.Protein Expression and Purification.2009(2)

[5]唐思远.人免疫球蛋白G的Fab和Fc片段制备及层析分离研究[D].浙江大学,2013.