人凝血酶(TM)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人凝血酶(TM)ELISA KIT用于检测血液、血清、胸腹水等其他体液中凝血酶(TM)的含量。

实验原理：人凝血酶(TM)ELISA KIT是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人凝血酶(TM)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人凝血酶(TM)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人凝血酶(TM)ELISA KIT

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

人凝血酶(TM)ELISA KIT用于地中海贫血患者组织因子微粒促凝活性及抗凝血酶Ⅲ检测的临床意义

通过检测地中海贫血患者血浆组织因子微粒(TF~+MP)促凝活性、凝血及抗凝物、纤溶功能、内皮细胞功能及血小板(PLT)计数,探讨地中海贫血患者是否存在可能引起血液高凝状态及血栓形成的高危因素。

方法:对71例地贫组及20例正常对照组分别用发色底物法检测血浆TF~+MP促凝活性、ELISA法检测血浆组织因子(TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)、蛋白C(PC)、蛋白S(PS)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、凝血酶激活的纤溶抑制物(TAFI)、可溶性E选择素(sE-sel)、可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)、可溶性血栓调节蛋白(sTM)水平。

结果:重型β地贫组(TM组)AT-Ⅲ水平较对照组(C组)降低(P<0.05),TM组AT-Ⅲ与PLT成独立正相关(rpPLT=0.37,P<0.05);中间型α地贫组(TA组)TF及sICAM-1水平较C组显著降低(P<0.01);脾切组(S组)及中间型β地贫组(TI组)血浆TF~+MP促凝活性较C组显著增高(P<0.05)并分别于sICAM-1和AT-Ⅲ呈独立正相关(r sICAM-1=0.84,P<0.05;rpAT-Ⅲ=0.77,P<0.05);S组PLT计数显著高于C组及非脾切组(NS组)(PC组<0.05 P NS组<0.01);肝功能正常组TF及sICAM-1水平较C组降低(P TF<0.01,P sICAM-1<0.05),肝功正常组与非正常组间TF~+MP活性有显著性差异(P<0.05);其余各组相应指标与C组相比及组间相比无显著性差异。

结论:重型β地贫患者存在肝功能损害及抗凝物质的减少;脾切及中间型β地贫患者血浆TF~+MP的促凝活性异常增高;脾切地贫患者PLT数量异常增高;这些因素可能增加地贫患者血液高凝状态或血栓形成风险。但外周血血浆sICAM-1及TF水平降低可能是中间型α地贫患者及肝功正常患者血栓形成的保护性因素。

参考文献

[1]Thrombin Activable Fibrinolysis Inhibitor in Beta Thalassemia.[J].Chhikara Aruna;;Sharma Sunita;;Chandra Jagdish;;Nangia Anita.Indian journal of pediatrics,2017(1)

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[4]Neutrophil activation and nucleosomes as markers of systemic inflammation in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria:effects of eculizumab[J].S.T.A.Bijnen;;D.Wouters;;G.J.Mierlo;;P.Muus;;S.Zeerleder.J Thromb Haemost,2015(11)

[5]苏谐.地中海贫血患者组织因子微粒促凝活性及抗凝血酶Ⅲ检测的临床意义[D].广西医科大学,2017.