人抗角蛋白抗体(AKA)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗角蛋白抗体(AKA)ELISA试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆或其它相关生物液体中抗角蛋白抗体(AKA)浓度。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗角蛋白抗体(AKA)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的抗角蛋白抗体(AKA)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗角蛋白抗体(AKA)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，抗角蛋白抗体(AKA)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中抗角蛋白抗体(AKA)的浓度。

人抗角蛋白抗体(AKA)ELISA试剂盒

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断与分析：

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的指标标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度,再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

应用^[4][5]

人抗角蛋白抗体(AKA)ELISA试剂盒用于基因工程人抗角蛋白抗体在人体组织和细胞内的反应定位及作用研究

通过免疫组织化学和免疫印迹等方法，观察FK3在人体不同组织和细胞内的反应定位，明确该抗体所识别的角蛋白，并在体外细胞培养实验中初步探讨该抗体对角质形成细胞增生代谢等方面的作用，为研制开发人抗角蛋白抗体的基因工程产品奠定坚实的基础。

首先，将FK315原核表达，通过ELISA试验证实所获得的Fab段与角蛋白具有较高的结合活性和特异性。其次，应用该抗体对正常人皮肤、正常人其它不同部位的组织以及银屑病、皮肤鳞癌、基底细胞癌、脂溢性角化病和恶性黑素瘤皮损进行免疫组织化学染色，观察该抗体在上述组织中的反应定位。结果发现，该抗体与正常人皮肤表皮不结合，在正常人其他组织中可与食管、支气管及肝脏等上皮组织发生反应；在银屑病，FK3与表皮全层结合，其中基底细胞层为强阳性反应；鳞癌和基底细胞癌的癌细胞胞浆均呈阳性反应，脂溢性角化病的皮损细胞亦呈明显的阳性反应，黑素瘤肿瘤细胞反应阴性，而瘤组织周围的表皮为阳性。各切片中所见毛囊均呈阳性反应，真皮呈阴性，其它皮肤附属器未见阳性反应。阴性对照及空白对照未见染色。

再次，应用免疫印迹的方法获得该抗体所结合的角蛋白条带的图片，——发现FK3与鼠抗人细胞角蛋白17MCAb所识别的角蛋白条带相同，通过凝胶分析软件得到的图表数据证实其所识别的角蛋白相对分子质量为46 000。通过ELISA竞争抑制试验的方法发现鼠抗人细胞角蛋白17MCAb与FK3之间具有明显的竟争抑制作用，进一步证实了FK3是抗角蛋白17（keratin 17，K17）的抗体。最后，将该抗体作用于培养的人角质形成细胞，在不同浓度和不同的作用时间应用酶免疫法细胞化学染色、免疫荧光细胞染色法及共聚集显微镜观察该抗体在角质形成细胞内的反应定位。

参考文献

[1]Follow-up of primary Sjogren’s syndrome patients presenting positive anti-cyclic citrullinated peptides antibody[J].Yang-Seon Ryu,Sung-Hwan Park,Jennifer Lee,Seung-Ki Kwok,Ji-Hyeon Ju,Ho-Youn Kim,Chan-Hong Jeon.Rheumatology International.2013(6)

[2]The clinical significance of anti-cyclic citrullinated peptide antibody in primary Sj?gren syndrome[J].So-Mi Kim,Eugene Park,Jung-Hwa Lee,Sang-Heon Lee,Hae-Rim Kim.Rheumatology International.2012(12)

[3]Secondary Sj?gren’s syndrome and disease activity of rheumatoid arthritis[J].Daniel C.Antero,AndréG.M.Parra,Fernando H.Miyazaki,Marcelo Gehlen,Thelma L.Skare.Revista da Associa??o Médica Brasileira.2011(3)

[4]Predictive and prognostic value of antinuclear antibodies and rheumatoid factor in primary Sjogren’s syndrome[J].An‐PingHUO,Kuan‐ChiaLIN,Chung‐TeiCHOU.International Journal of Rheumatic Diseases.2010(1)

[5]卢宁.基因工程人抗角蛋白抗体在人体组织和细胞内的反应定位及作用研究[D].中国人民解放军第四军医大学,2003.