人细胞膜表面免疫球蛋白(SMIG)ELISA 试剂盒的应用

背景^[1-3]

人细胞膜表面免疫球蛋白(SMIG)ELISA试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆或其它相关生物液体中细胞膜表面免疫球蛋白(SMIG)浓度。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用细胞膜表面免疫球蛋白(SMIG)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的细胞膜表面免疫球蛋白(SMIG)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的细胞膜表面免疫球蛋白(SMIG)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，细胞膜表面免疫球蛋白(SMIG)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中细胞膜表面免疫球蛋白(SMIG)的浓度。

人细胞膜表面免疫球蛋白(SMIG)ELISA试剂盒

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

人细胞膜表面免疫球蛋白(SMIG)ELISA 试剂盒用于外泌体在肌肉萎缩症中的诊疗作用研究

探究exosome在肌肉萎缩症诊疗中的应用可行性和潜力,以期为肌肉萎缩症诊治提供一种新方法和策略。方法:从健康人和dysferlin肌病患者的血清和尿液中,利用超速离心的方法提取exosome,并利用电镜、纳米检测仪和Western blot进行形态和表达谱鉴定。利用Western blot检测并比较健康人和患者血清及尿液来源exosome中dysferlin蛋白的表达水平,以探究携带dysferlin的exosome是否可用于dysferlin肌病的诊断。

利用ELISA检测并比较血清和尿液来源exosome中dysferlin表达,以建立该方法的临床诊断标准。利用Western blot检测其他类型肌肉萎缩症患者血清及尿液来源exosome携带相关功能蛋白的表达水平,以探究exosome在其他肌肉萎缩症诊断的可行性。为探究exosome对肌肉萎缩症的治疗作用,分别在dysferlin肌病和DMD肌肉萎缩症模型上进行了系统测试。在dysferlin肌病测试中,利用Western blot对不同细胞来源的exosome进行dysferlin表达鉴定,筛选高负载dysfelrin蛋白的exosome（EXOdysf）。

利用激光扫描共聚焦显微镜检测PKH67标记的exosome在dysfelrin缺失细胞（DYSF-/-）内的定位情况,采用Western blot及免疫荧光染色方法检测exosome处理的细胞中dysferlin蛋白的表达及定位情况,以确认EXOdysf作为运输载体的可行性及效率。

将EXOdysf与DYSF-/-细胞共孵育48小时,利用双光子激光扫描共聚焦显微镜对肌管膜进行损伤,以测试EXOdysf对DYSF-/-细胞膜损伤修复的作用;利用免疫荧光染色检测受损DYSF-/-细胞膜表面溶酶体标志性蛋白LAMP-1的表达,以确定EXOdysf是否通过恢复dysferlin蛋白表达,从而促进溶酶体在细胞膜损伤修复过程中的作用;通过对细胞损伤修复过程荧光探针Fluo-3 AM标记的Ca2+流的变化,以探究EXOdysf是否可以调节膜损伤后Ca2+稳态。

利用CRISPR-Cas9基因组编辑系统,对人DYSF基因外显子22和55进行缺失突变,获得dysferlin蛋白表达缺失的人细胞模型;将人血清来源exosome（EXOser）与dysferlin蛋白表达缺失细胞共孵育,利用Western blot检测dysferlin蛋白的传递及表达;通过膜损伤修复试验检测血清来源exosome在人源细胞模型上对膜损伤修复的作用。

在DMD模型的测试中,利用DMD疾病模型mdx小鼠,收集不同细胞来源exosome,按150μg/只exosome剂量,以腹腔注射的方式,每周注射两次,连续注射3周。通过小鼠抓力的测试、血清肌酸激酶（CK）等方法来检测肌肉功能是否得到改善。利用体重变化的监测、肝脏和肾脏生化指标评估其安全性。利用H＆E肌肉病理切片染色、炎症细胞标志性蛋白的免疫组织化学染色以及炎症因子RT-PCR定量分析检测肌肉组织病理上的改善情况。

利用血清免疫球蛋白（Ig G）染色来探究肌细胞膜完整性的改变;利用Western blot检测肌肉再生与分化相关的标志性蛋白的表达,以探究exosome对肌肉再生与分化功能的影响,并利用CTX急性损伤模型进行确认。通过Western blot和免疫荧光染色检测dystrophin相关蛋白复合体的表达及定位,以探究exosome对dystrophin蛋白相关功能蛋白复合体的恢复情况。针对dystrophin蛋白功能复合体的表达恢复及正确定位,利用Western blot、RT-PCR和免疫荧光染色分别从蛋白转运、m RNA水平改变、糖基化转移酶表达水平以及胞内蛋白酶体的表达及活性进行检测,以阐释exosome改善损伤肌肉功能的机制。

参考文献

[1]Biogenesis and function of ESCRT-dependent extracellular vesicles[J].Thomas Juan,Maximilian Fürthauer.Seminars in Cell and Developmental Biology.2018

[2]Pharmacological inhibition of REV-ERB stimulates differentiation,inhibits turnover and reduces fibrosis in dystrophic muscle.[J].Welch Ryan D,Billon Cyrielle,Valfort Aurore-Cecile,Burris Thomas P,Flaveny Colin A.Scientific reports.2017(1)

[3]Diagnostic potential of serum exosomal colorectal neoplasia differentially expressed long non-coding RNA（CRNDE-p）and microRNA-217 expression in colorectal carcinoma.[J].Yu Bo,Du Qiong,Li Huan,Liu Hong-Yue,Ye Xuan,Zhu Bin,Zhai Qing,Li Xin-Xiang.Oncotarget.2017(48)

[4]Treatment with Recombinant Human MG53 Protein Increases Membrane Integrity in a Mouse Model of Limb Girdle Muscular Dystrophy 2B[J].Liubov V.Gushchina,Sayak Bhattacharya,Kevin E.McElhanon,Jin Hyuk Choi,Heather Manring,Eric X Beck,Jenna Alloush,Noah Weisleder.Molecular Therapy.2017(10)

[5]董雪.外泌体在肌肉萎缩症中的诊疗作用研究[D].天津医科大学,2018.