载脂蛋白A1抗体的应用

背景^[1-3]

载脂蛋白A1抗体是一类可以特异性结合载脂蛋白A1的多克隆抗体，主要用于体外检测载脂蛋白A1的免疫学实验。

载脂蛋白是血浆脂蛋白中的蛋白质部分，能够结合和运输血脂到机体各组织进行代谢及利用的蛋白质。大量研究发现载脂蛋白基因发生突变，形成不同等位基因型多态性，并进一步形成不同表型的载脂蛋白，可影响血脂代谢和利用，从而影响高脂血症、动脉粥样硬化、心脑血管疾病等的发生和发展。

载脂蛋白A1抗体免疫组化

载脂蛋白是构成血浆脂蛋白的蛋白质组分，主要分A、B、C、D、E五类。基本功能是运载脂类物质及稳定脂蛋白的结构，某些载脂蛋白还有激活脂蛋白代谢酶、识别受体等功能。主要在肝（部分在小肠）合成，按ABC系统命名，各类又可细分几个亚类，以罗马数字表示。载脂蛋白是构成血浆脂蛋白的重要组分，赋予脂类以可溶的形式，而且在血浆脂蛋白代谢中起重要作用：（1）促进脂类运输；（2）调节酶活性；（3）引导血浆脂蛋白同细胞表面受体结合。是功能上极其活跃的一组血浆蛋白质。

载脂蛋白A族载脂蛋白A（ApoA）可分为ApoAⅠ、ApoAⅡ、ApoAⅣ。ApoAⅠ和ApoAⅡ大部分布在HDL中，是HDL的主要载脂蛋白。

ApoAⅠ是ApoA族最多的一种组分，是HDL中的主要载脂蛋白。Shore等于1968年首先从人HDL中分离纯化得到ApoAⅠ。1970年代中期Brewer阐明了ApoAⅠ的氨基酸序列，并预测了其二级结构的要点。在分子生物学兴起的80年代，Karathanasis等人相继报道了人ApoAⅠcDNA和染色体DNA序列。人成熟的ApoAⅠ的由243氨基酸残基组成，是单一多肽链，分子量为28300D。人及大鼠、猴、兔、牛、鸭、树鼷等动物的ApoAⅠ已分离纯化。人和其他种属的ApoAⅠ的氨基末端为Asp，羧基末端为Gln，其分子中不含半胱氨酸和异亮氨酸。经等点聚焦电泳证实人和动物的ApoAⅠ都是不均一的，有10种不同的亚组分，至少有六种多态性。经等电聚焦和双相电泳中的系统命名，ApoAⅠ多肽性依次称为ApoaⅠ0、ApoAⅠ-1、ApoAⅠ-2、ApoAⅠ+1、ApoAⅠ+2，其中ApoAⅠ0含量最多。

应用^[4][5]

载脂蛋白A1抗体用于HCV核心蛋白单克隆抗体制备及其与载脂蛋白A1、转位蛋白相互作用研究

构建丙型肝炎核心蛋白（HCV core）原核表达载体,在大肠埃希菌中进行表达、并纯化融合蛋白;制备抗core蛋白单克隆抗体并进行鉴定。研究HCVcore在肝源性细胞系中与载脂蛋白A1（apoA1）、转位蛋白（Translin）相互作用,为丙型肝炎病毒引起的脂肪肝和肝癌的分子机制提供理论基础。

方法:构建原核表达载体pET-32a（+）HCV-core,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导获得core融合蛋白。利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及上柱复性。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,获得抗HCV-core蛋白的单克隆抗体。利用Western blot、ELISA法和免疫组化对单克隆抗体进行特异性和灵敏度分析及鉴定。构建真核表达质粒:pDNA3.1-myc-his-载脂蛋白A1、pDNA3.1-myc-his-Translin、pDNA3.1（-）core、pact-

载脂蛋白A1、pact-Translin和pBIND-core,共转染到HepG2细胞中。用免疫共沉淀（CoIP）和哺乳动物双杂交的方法,Westren blot分析免疫共沉淀杂交带,用Dual Luciferase Reporter AssaySystem检测荧光素酶强度。

结果:1:HCV核心蛋白基因PCR产物及连接到pET32a（+）中,经双酶切和DNA测序鉴定,成功构建pET-32a（+）-core,HCV-core融合蛋白表达成功。通过Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化,获得core蛋白（42KD）。用纯化蛋白常规免疫BALB/c小鼠,并鼠尾静脉取血。用ELISA检测免疫后小鼠血清出现抗core抗体,并且血清抗体滴度成逐渐增高趋势。Western blot证明血清抗体能检测到HCV肝硬化患者肝组织中core蛋白,进一步证明我们制备的core融合蛋白与天然存在的core蛋白结构基本一致。

用脾细胞与骨髓瘤细胞融合,细胞融合率59.2%。用ELISA和Westren blot筛选单克隆抗体株阳性率6.3%。有限稀释再次筛选共获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA测定其效价,上清效价最高的细胞株是4E10。以4E10细胞上清作为一抗,Western blot检测纯化抗原可检测到8ng的抗原;免疫组织化学发现:在HCV肝癌组织中,HCVcore主要位于肝细胞胞浆中,呈灶性或弥漫性分布。

2:共转染pDNA3.1-myc-his 载脂蛋白A1和pDNA3.1（-）HCVcore进入HepG2细胞中,经免疫共沉后Western blot结果显示:单独core蛋白的杂交带相对分子量大概19kDa,共沉淀带相对分子量大约50kDa。所构建的真核载体能在HepG2细胞中表达,并且HCVcore和载脂蛋白A1二种蛋白能相互结合。而且也用pDNA3.1-myc-hisapoA1和pDNA3.1（-）HCVcore单独转染入HepG2细胞中,每种质粒都能在细胞中过表达,且不与HepG2细胞内其它蛋白结合。pACT-apoAⅠ和pBIND-core共转染时,相对荧光素酶活性值较pACT和pBIND空载体转染组以及pACT-apoA1和pBIND空载体、pACT空载体和pBIND-core转染组明显升高（12～16倍）。表明HCVcore和载脂蛋白A1在体内能相互结合,且单独转染后没有自身激活作用。

3:共转染pDNA3.1-myc-his Translin和pDNA3.1（-）HCVcore进入HepG2细胞中,经免疫共沉后Western blot结果显示:单独core蛋白的杂交带相对分子量大概19kDa,共沉淀带只出现Translin蛋白杂交带相对分子量大约21.8kDa。pACT-Translin和pBIND-core共转染时,相对荧光素酶活性值较其他组明显升高（6～8倍）。表明HCVcore和Translin在体内能相互结合。

结论:成功表达、纯化HCV-core基因融合蛋白,获得高特异性、高效价鼠抗HCV-core单克隆抗体,为研究core基因的生物学功能提供了新的手段。HCV-core可与载脂蛋白A1、Translin在体内相互作用,为慢性丙型肝炎致肝脂肪变和肝癌的机制的研究提供理论依据。

参考文献

[1]Liver Microsomal Triglyceride Transfer Protein Is Involved in Hepatitis C Liver Steatosis[J].Silvia Mirandola,Stefano Realdon,Jahangir Iqbal,Martina Gerotto,Francesca Dal Pero,Gladis Bortoletto,Moira Marcolongo,Alessandro Vario,Christian Datz,M.Mahmood Hussain,Alfredo Alberti.Gastroenterology.2006(6)

[2]High body mass index is an independent risk factor for nonresponse to antiviral treatment in chronic hepatitis C[J].Brian L.Bressler,Maha Guindi,George Tomlinson,Jenny Heathcote.Hepatology.2003(3)

[3]Effect of treatment with peginterferon or interferon alfa-2b and ribavirin on steatosis in patients infected with hepatitis C[J].Thierry Poynard,Vlad Ratziu,John McHutchison,Michael Manns,Zachary Goodman,Stefan Zeuzem,Zobair Younossi,Janice Albrecht.Hepatology.2003(1)

[4]Hepatitis C Virus NS5A Colocalizes with the Core Protein on Lipid Droplets and Interacts with Apolipoproteins[J].Stephanie T.Shi,Stephen J.Polyak,Hong Tu,Deborah R.Taylor,David R.Gretch,Michael M.C.Lai.Virology.2002(2)

[5]沈静.HCV核心蛋白单克隆抗体制备及其与载脂蛋白A1、转位蛋白相互作用[D].安徽理工大学,2008.