组织蛋白酶B抗体的应用

背景^[1-3]

组织蛋白酶B抗体是一类可以特异性结合组织蛋白酶B的多克隆抗体，主要用于体外检测组织蛋白酶B的免疫学实验。

蛋白酶是人体内蛋白水解的主要参与者，根据其底物特异性可将其分为肽链内切酶、肽链端解酶、氨基肽酶和羧肽酶等；根据其蛋白水解机制分类为丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。其中半胱氨酸蛋白酶研究较多。它广泛存在于病毒、细菌、真菌、原生动物及原虫、植物、哺乳动物和人当中，其的亚族是木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶。哺乳动物中的木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶即属于组织蛋白酶(Cathepsin)，它是一类主要存在于溶酶体中的胞内蛋白酶，弱酸性环境中易被活化，是一类在碱性和中性溶液中不稳定的糖蛋白(除组织蛋白酶D、E、S外)。

组织蛋白酶B

组织蛋白酶B（CTSB）是溶酶体内半胱氨酸蛋白水解酶，其催化作用由Cys，His实现，易被巯基试剂抑制，又称巯基酶，属于木瓜蛋白酶家族，在pH 3.0～7.0都具有活性，碱性条件下会不可逆失活。

CTSB存在于细菌、病毒、原生动物、植物和哺乳动物中，在肝、脾、肾、骨、神经细胞、间质成纤维细胞、巨噬细胞等都有分布。CB在溶酶体降解蛋白质途径中发挥着必不可少的作用，当胞外蛋白质、血浆蛋白、激素和被吞噬的细菌等进入细胞即被溶酶体内蛋白水解酶水解，进行细胞内消化，从而使蛋白质的合成与降解保持精确的平衡。

.近年来发现组织蛋白酶B(CB)与肿瘤的浸润转移有关，CB在癌细胞转移过程中，能直接地溶解或者间接地激活能够溶解细胞外基质，如胶原蛋白、层粘连蛋白、基底膜等成分的酶来促进肿瘤细胞向深部组织浸润，从而为癌细胞的移动打开通道。研究发现CB在多种肿瘤细胞，如胃癌、肺癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌等癌细胞中均有较高的表达；且mRNA的表达与癌的组织学类型、分化的阶段有一定的关系，但蛋白质水平却相反，这种差异可能在转录及转录后水平上存在着某种调节，从而影响了最后的表达;癌周间质细胞及血管内皮细胞CB增强表达.正常情况下间质成纤维细胞及巨噬细胞也可分泌CB，但癌时期表达明显增高，说明在癌浸润转移过程中，巨噬细胞CB的过度合成与渗漏了，也可能参与到癌细胞的扩散机制中。

应用^[4][5]

组织蛋白酶B抗体用于组织蛋白酶B在骨肉瘤增殖、迁移及侵袭中的作用研究

通过构建抑制组织蛋白酶B基因表达的抑制物,探究组织蛋白酶B对骨肉瘤细胞增殖、浸润、迁移等细胞功能学的影响,进一步揭示骨肉瘤转移与复发的分子机制,为骨肉瘤的治疗提供新的作用靶点。

通过购买骨肉瘤患者的肿瘤组织及癌旁组织标本,研究骨肉瘤组织及癌旁组织中组织蛋白酶B蛋白表达的差异性。并观察沉默组织蛋白酶B后MG63细胞增殖、迁移及侵袭的改变,以探讨组织蛋白酶B对骨肉瘤细胞功能的影响。

方法1.利用免疫组化技术观测骨肉瘤组织及癌旁组织中组织蛋白酶B表达的差异。

2. 利用脂质体2000转染法将特异性沉默组织蛋白酶B基因的小干扰RNA（siRNA）瞬时转染进骨肉瘤MG63细胞中。实验分组如下:（1）Blank组:只转染入脂质体试剂;（2）siRNA-1组:转染CB-siRNA-1;（3）siRNA-2组:转染CB-siRNA-2;（4）siRNA-3组:转染CB-siRNA-3;（5）NC组:转染negative control-siRNA。

3. 利用免疫印迹（Western blot）实验方法检测各组在转染后组织蛋白酶B表达的差异,并从siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组挑选出沉默效率最高者作为后续实验组。

4. 利用CCK-8实验及克隆形成实验,检测各组MG63细胞增殖情况,分析各组细胞的增殖能力是否存在差异。

5. 利用细胞划痕实验,检测各组MG63细胞的迁移情况,分析各组细胞的迁移能力是否存在差异。

6. 通过Transwell实验,检测各组MG63细胞的侵袭情况,分析各组细胞的侵袭能力是否存在差异。

结果1.骨肉瘤组织与癌旁组织相比,组织蛋白酶B的表达明显升高。

2. siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组均可显著下调骨肉瘤MG63细胞中组织蛋白酶B的表达,与NC组及Blank组相比P＜0.001。且siRNA-2组下调效果最为明显,其与siRNA-1组、siRNA-3组相比P＜0.05。因此将siRNA-2组作为后续实验组。

3.CCK-8实验中siRNA-2组与Black组相比,其450nm波长吸光度值（OD450值）在24h、48h、72h均明显降低,P均小于0.05,而在0h、96h差异无统计学意义（P＞0.05）。

4.单克隆形成实验中,siRNA-2组细胞克隆形成数明显低于Blank组及NC组（P＜0.001）,Blank组与NC组之间无明显差异（P＞0.05）。

5.细胞划痕实验表明,siRNA-2组细胞愈合率在6h明显低于Blank组及NC组（P＜0.01）,在12h细胞愈合率也明显低于Blank组及NC组（P＜0.001）。Blank组与NC组相比细胞愈合率在6h及12h均无明显差异,无统计学意义（P＞0.05）。

6.Transwell实验表明,siRNA-2组中穿过小室基底膜的细胞与Blank组及NC组相比明显减少,差异有统计学意义（P＜0.001）。Black组与NC组相比,穿过小室基底膜的细胞数相差不大,无统计学意义（P＞0.05）。

结论1.骨肉瘤组织中组织蛋白酶B的表达明显增高。2.组织蛋白酶B具有增强骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力的作用。

参考文献

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