大鼠乙醛脱氢酶(ALDH)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

大鼠乙醛脱氢酶(ALDH)ELISA KIT用于体外定量检测人血清、血浆或其它相关生物液体中乙醛脱氢酶(ALDH)浓度。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗乙醛脱氢酶(ALDH)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的乙醛脱氢酶(ALDH)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗乙醛脱氢酶(ALDH)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，乙醛脱氢酶(ALDH)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中乙醛脱氢酶(ALDH)的浓度。

大鼠乙醛脱氢酶(ALDH)ELISA KIT

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断与分析：

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的指标标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度,再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

应用^[4][5]

用于线粒体乙醛脱氢酶2在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及机制探讨研究

研究通过短暂性的全脑缺血后恢复血流供应的方法来模拟脑缺血再灌注模型,首先观察细胞色素c抑制剂是否对缺血再灌注损伤下的脑细胞具有保护作用,分析ALDH2在其中的可能作用,进一步研究ALDH2基因过表达是否可以减轻缺血再灌注引起的脑细胞死亡。

方法:部分:分析细胞色素c抑制剂及ALDH2在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用。雄性成年SD大鼠随机分为Sham组、脑缺血再灌注损伤组（I/R）、ALDH2激动剂Alda-1+I/R组、细胞色素c抑制剂Bax channel blocker（Bcb）+I/R组,HE染色观察海马CA1区细胞形态学改变;免疫组化观察ALDH2及炎症小体相关蛋白NLRP3的表达,分光光度法检测ALDH2的活性,Western Blot检测NLRP3及IL-1β、IL-18蛋白的变化,同时检测ALDH2及4-HNE的蛋白表达。

第二部分:为进一步明确ALDH2在大鼠脑缺血再灌注损伤中的保护作用及可能机制,SD大鼠随机分为四组:Sham组、I/R组、ALDH2腺相关病毒过表达组（AAV9-ALDH2+I/R）、ALDH2腺相关病毒过表达+线粒体复合物1的抑制剂Rotenone组（AAV9-ALDH2+I/R+Rotenone组）。免疫荧光检测AAV9-ALDH2在脑细胞内的情况,HE染色观察海马区细胞的形态学改变,免疫组化检测海马CA1区脑细胞中的ALDH2、NLRP3表达情况,Western Blot检测ALDH2、4-HNE及焦亡通路GSDMD蛋白表达。

结果:部分:与Sham组相比,I/R组海马CA1区细胞存活率明显下降;细胞色素c抑制剂Bcb干预提高了海马CA1区细胞存活率（P＜0.01）;与I/R组相比,Bcb干预后ALDH2活性和蛋白表达增加,炎症小体关键因子NLRP3、IL-1β、IL-18及4-HNE表达下降（P＜0.01）。Alda-1激动ALDH2后,与I/R组相比,海马CA1区细胞存活率增高,NLRP3、IL-1β、IL-18及4-HNE表达降低。第二部分:与I/R组相比,AAV9-ALDH2过表达组海马CA1区细胞存活率增加（P＜0.01）,ALDH2蛋白表达增加（P＜0.01）,NLRP3、GSDMD、4-HNE表达下降（P＜0.01）。与AAV9-ALDH2+I/R组相比,Rotenone促进线粒体氧化应激未能减轻AAV9-ALDH2的保护作用。

结论:1.大鼠全脑缺血再灌注损伤模型中,细胞色素c抑制剂可通过减少炎症小体的生成、促进ALDH2的表达发挥保护作用;2.大鼠全脑缺血再灌注损伤模型中,NLRP3炎症小体相关蛋白表达增高;ALDH2过表达促进ALDH2的表达可降低炎症小体关键蛋白生成、抑制焦亡发挥保护作用。

参考文献

[1]Inhibiting the interaction between apoptosis-inducing factor and cyclophilin A prevents brain injury in neonatal mice after hypoxia-ischemia[J].Juan Rodriguez,Cuicui Xie,Tao Li,Yanyan Sun,Yafeng Wang,Yiran Xu,Kenan Li,Shan Zhang,Kai Zhou,Yong Wang,Carina Mallard,Henrik Hagberg,Nunzianna Doti,Xiaoyang Wang,Changlian Zhu.Neuropharmacology.2020(prep)

[2]Mitochondrial and mitochondrial-independent pathways of myocardial cell death during ischaemia and reperfusion injury.[J].Davidson Sean M,AdameováAdriana,Barile Lucio,Cabrera-Fuentes Hector Alejandro,Lazou Antigone,Pagliaro Pasquale,Stensl?kken K?re-Olav,Garcia-Dorado David.Journal of cellular and molecular medicine.2020(7)

[3]RIPC provides neuroprotection against ischemic stroke by suppressing apoptosis via the mitochondrial pathway.[J].Lv Jing,Guan Weikang,You Qiang,Deng Li,Zhu Yan,Guo Kan,Gao Xiaoqing,Kong Jiming,Yang Chaoxian.Scientific reports.2020(1)

[4]Small-Molecule Inhibitors of Necroptosis:Current Status and Perspectives.[J].Zhuang Chunlin,Chen Fener.Journal of medicinal chemistry.2020(4)

[5]方典.线粒体乙醛脱氢酶2在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用及机制探讨[D].蚌埠医学院,2021.