人抗中性粒细胞胞浆抗体(CANCA)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人抗中性粒细胞胞浆抗体(CANCA)ELISA KIT 用于体外定量检测人血清、血浆或其它相关生物液体中抗中性粒细胞胞浆抗体(CANCA)浓度。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗抗中性粒细胞胞浆抗体(CANCA)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的抗中性粒细胞胞浆抗体(CANCA)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗抗中性粒细胞胞浆抗体(CANCA)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，抗中性粒细胞胞浆抗体(CANCA)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中抗中性粒细胞胞浆抗体(CANCA)的浓度。

人抗中性粒细胞胞浆抗体(CANCA)ELISA KIT

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于抗中性粒细胞胞浆抗体相关性小血管炎患者血清炎性因子与visfatin的表达研究

（1）探讨抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）及其靶抗原蛋白酶3（PR3）和髓过氧化物酶（MPO）的检测对ANCA相关性小血管炎（AASV）的应用价值；

（2）观察AASV患者在小血管炎症活动期,血清炎性因子C反应蛋白（CRP）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和内脏脂肪素（visfatin）的浓度变化及缓解期走向；

（3）分析主要由内脏脂肪分泌的visfatin在AASV炎性损伤和免疫调控方面的作用,及其与CRP、IL-6、TNF-α间的潜在关联。

方法：对52例AASV活动期与25例缓解期血清样本采用间接免疫荧光法检测ANCA,依据荧光显微镜下免疫荧光的着染部位不同分为胞浆型ANCA（cANCA）和核周型ANCA（pANCA）;应用酶联免疫吸附法测量PR3、MPO、IL-6、TNF-α及visfatin;免疫比浊法测定CRP含量。

结果：（1）cANCA与pANCA各自识别对应的靶抗原PR3和MPO,具有靶抗原特异性（P＜0.001）,且较长时间内不随疾病的转归而改变（P＞0.05）。

（2）AASV活动期CRP、IL-6、TNF-α、visfatin水平较正常对照组均升高（P＜0.001）；活动期与缓解期比较CRP（P＜0.05）、IL-6（P＜0.001）含量不同程度下降；TNF-α没有明显降低（P＞0.05）；而AASV缓解期visfatin含量较治疗前仍继续升高（P＜0.05）。缓解期与对照组比较CRP（P＜0.001）、TNF-α（P＜0.05）、visfatin（P＜0.001）仍有差异,但IL-6已接近正常对照组（P＞0.05）。

（3）AASV患者各炎性因子间均呈正相关性,CRP与IL-6间的相关系数为0.471（P＜0.001）,CRP与TNF-α间的相关系数为0.315（P＜0.05）,CRP与visfatin间的相关系数为0.364（P＜0.01）,IL-6与TNF-α司的相关系数性为0.458（P＜0.01）,IL-6与visfatin间的相关系数为0.577（P＜0.001）,TNF-α与visfatin间的相关系数为0.550（P＜0.001）。

结论：ANCA及其靶抗原PR3和MPO的检测具有重要的疾病诊断价值,但由于其在体内浓度维持时间较长,不能用ANCA及其靶抗原水平来预知血管炎的活动性、治疗效果、缓解和/或已经复发。数据显示,AASV活动期与对照组比较,血清炎性因子CRP、IL-6、TNF-α和visfatin浓度显著升高,且各炎性因子和visfatin间存在正相关调控关系。

在缓解期CRP、IL-6、出现不同程度的下调,而TNF-α含量回落不明显,缓解期血清visfatin的含量较活动期仍有所升高,提示visfatin和TNF-α之间存在互为调控的剂量依赖关系,visfatin的这一变化可能也预示着AASV这一慢性消耗性疾病在维持缓解期内脏脂肪细胞的缓慢修复,对延长患者的中性粒细胞的生存时间起作用。

参考文献

[1]Adipocytokines,insulin resistance,and coronary atherosclerosis in rheumatoid arthritis[J].Young HeeRho,Cecilia P.Chung,Joseph F.Solus,PaoloRaggi,AnnetteOeser,TebebGebretsadik,AyumiShintani,C.MichaelStein.Arthritis＆Rheumatism.2010(5)

[2]Adipocytokines are associated with radiographic joint damage in rheumatoid arthritis[J].Rho Young Hee,Solus Joseph,Sokka Tuulikki,Oeser Annette,Chung Cecilia P,Gebretsadik Tebeb,Shintani Ayumi,Pincus Theodore,Stein C Michael.Arthritis and rheumatism.2009(7)

[3]A multicenter survey of rituximab therapy for refractory antineutrophil cytoplasmic antibody–associated vasculitis[J].Jones Rachel B,Ferraro Alastair J,Chaudhry Afzal N,Brogan Paul,Salama Alan D,Smith Kenneth G C,Savage Caroline O S,Jayne David R W.Arthritis and rheumatism.2009(7)

[4]Nicotinamide phosphoribosyl transferase/pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin is required for lymphocyte development and cellular resistance to genotoxic stress.[J].Rongvaux Anthony,Galli Mara,Denanglaire Sébastien,Van Gool Frédéric,Drèze Pierre L,Szpirer Claude,Bureau Fabrice,Andris Fabienne,Leo Oberdan.Journal of immunology（Baltimore,Md.:1950）.2008(7)

[5]邢娜.抗中性粒细胞胞浆抗体相关性小血管炎患者血清炎性因子与visfatin的表达[D].天津医科大学,2012.