小鼠血清总补体(CH50)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠血清总补体(CH50)ELISA试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中血清总补体(CH50)含量。

实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中血清总补体(CH50)水平。用纯化的血清总补体(CH50)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入血清总补体(CH50)，再与HRP标记的血清总补体(CH50)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的血清总补体(CH50)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中血清总补体(CH50)浓度。

小鼠血清总补体(CH50)ELISA试剂盒

准备试剂与收集血样

1.收集标本：血清、血浆（EDTA、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。正常标本测定前用标本稀释液作1：1 0稀释（取2 0ul，加标本稀释液18 0ul,稀释1 0倍）。

2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成2 0 000U/ml的溶液。设标准管8管，管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入2000 0 U/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:1 0倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔中加入抗体工作液10 0ul。将反应板充分混匀后置37℃6 0分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃3 0分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在45 0 nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品20 00、100 0、500、250、125、62.5、31.2、0 U/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应OLab含量，再乘上稀释倍数1 0即可。

应用^[4][5]

用于基于自身红细胞构建的溶血系统检测总补体活性及其与MICA基因多态性的关系研究

在CH50溶血法的基础上,以人红细胞替代绵羊红细胞,将多管法转化为单管法,创建一种操作简单,稳定可靠的检测血浆补体总活性的新方法。同时本文应用该法检测ICU患者,冠心病患者,健康体检者的血浆补体总活性,并在分子水平上研究了冠心病患者补体活性与MICA*008基因携带的关系。

方法:1.首先以绵羊红细胞替代人红细胞,兔抗人红细胞抗体替代兔抗羊红细胞抗体（溶血素）进行溶血试验,证明不同红细胞浓度和血浆浓度对红细胞破坏后释放血红蛋白效能的影响。并通过CH50多管法溶血试验确定发生溶血反应的各种试剂的最适浓度,创建单管溶血比色法。同时通过线性研究和重复试验验证了该法的准确度和稳定性。

2. 使用CH50标准法检测血浆和血清中的补体活性,并使用单管溶血比色法检测以不同人红细胞作为溶血指示系统的同一份血浆中的补体活性,进一步验证单管溶血比色法的可行性。

3. 使用CH50法和单管溶血比色法检测同一份血浆的补体活性,验证两种方法的相关性。

4. 使用单管溶血比色试验检测ICU患者,冠心病患者和健康体检者的补体总活性,证明该方法有一定的临床应用价值。同时采用PCR技术检测冠心病患者和健康者的MICA*008基因携带情况,分析冠心病患者补体活性与MICA*008基因的关系。

结果:1.用人红细胞和兔抗人红细胞抗体替代绵羊红细胞和溶血素进行溶血试验,结果发现不同浓度的红细胞对溶血程度的影响低于不同浓度的血浆对溶血程度的影响,同时,得出当血浆浓度为20%时,红细胞浓度的不同对红细胞破坏后释放血红蛋白的效能影响最低。因此将20%红细胞悬液所对应第九管（20%血浆浓度）中各成分的含量,作为单管溶血比色法中各成分比例的参考。

应用单管溶血比色法检测不同浓度血浆的补体活性,并连续5天测定同一份血浆的补体活性,结果证明不同浓度血浆的补体总活性呈线性分布,连续5天所测定的补体活性值的变异系数CV=11.3%,说明单管溶血比色试验具有一定的准确性和稳定性。

2. 通过CH50标准法检测血浆和血清中的补体活性,本文得出血浆和血清中的补体活性完全相同,因此可以使用血浆替代血清标本进行补体活性测定,补体检测技术得到了优化。同时,通过不同人红细胞作为溶血指示系统检测同一份血浆中的补体活性,得出血浆中的补体活性大致相同（P＞0.05）,说明不同红细胞不会影响血浆中的补体含量,单管溶血法具有可行性。

3. 该方法中测定的溶血OD值与CH50溶血法所测的补体活性值两者呈线性相关,说明单管溶血比色法与CH50法具有显著的相关关系,单管溶血比色法可以替代CH50溶血法检测补体总活性。

4.ICU患者和冠心病患者的补体活性要显著低于健康体检者的补体活性,单管溶血比色法有一定的临床应用价值。冠心病患者和健康体检者的MICA*008基因分布大致相同,同时冠心病患者的补体水平与MICA*008的携带没有显著关联。

参考文献

[1]Complement and HIV-I infection/HIV-associated neurocognitive disorders[J].Fengming Liu,Shen Dai,Jennifer Gordon,Xuebin Qin.Journal of NeuroVirology.2014(2)

[2]Overview of Complement Activation and Regulation[J].Marina Noris,Giuseppe Remuzzi.Seminars in Nephrology.2013(6)

[3]Targeting the complement system in systemic lupus erythematosus and other diseases[J].Maria-Louise Barilla-LaBarca,Kiley Toder,Richard Furie.Clinical Immunology.2013

[4]Use of complement regulators,CD35,CD46,CD55,and CD59,on leukocytes as markers for diagnosis of viral and bacterial infections[J].Jari Nuutila,P?ivi Jalava-Karvinen,Ulla Hohenthal,Pirkko Kotilainen,Tarja-Terttu Pelliniemi,Jukka Nikoskelainen,Esa-Matti Lilius.Human Immunology.2013

[5]董蕊锐.基于自身红细胞构建的溶血系统检测总补体活性及其与MICA基因多态性的关系[D].大连医科大学,2016.