小鼠硫氧还蛋白还原酶(TRXR)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠硫氧还蛋白还原酶(TRXR)ELISA KIT用于测定人血清、血浆及相关液体样本中硫氧还蛋白还原酶(TRXR)的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被硫氧还蛋白还原酶(TRXR)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的硫氧还蛋白还原酶(TRXR)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

小鼠硫氧还蛋白还原酶(TRXR)ELISA KIT

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于以硫氧还蛋白还原酶为靶点的天然化合物抗肿瘤机制研究

硫氧还蛋白还原酶（TrxR）是生物体内依赖于NADPH的氧化还原调节蛋白,它主要通过作用于其底物分子硫氧还蛋白（Trx）来维持细胞的氧化还原平衡以及调控氧化还原所介导的信号转导,进而控制着细胞的增殖、分化和死亡等重要的生理过程。

研究了藤黄酸、紫草素和小白菊内酯等几类具有抗肿瘤活性的天然小分子与TrxR的相互作用,以及此种作用与它们抗肿瘤活性之间的关系。主要的内容如下：1.概述了TrxR的分布、结构和催化机理以及其生理功能,并对近期报道的具有抗肿瘤活性的TrxR抑制剂进行了简单的综述。

2. 藤黄酸对许多癌细胞具有很强的细胞毒活性,并且已进入二期临床研究。我们研究发现,藤黄酸可以选择性地抑制TrxR,产生氧化应激并诱导肝癌细胞SMMC-7721的凋亡。藤黄酸主要靶向TrxR的硒半胱氨酸（Sec）而抑制其还原Trx的活性,导致细胞内活性氧（ROS）累积、破坏氧化还原平衡。进一步研究表明,过表达细胞内的TrxR能够降低藤黄酸的细胞毒活性,而降低细胞内TrxR时可以增加细胞对藤黄酸的敏感性,支持了藤黄酸与TrxR相互作用的生理意义。我们的研究揭示了藤黄酸抗肿瘤作用的新机制,即可以通过作用于TrxR而诱导肿瘤细胞发生氧化应激介导的凋亡,这将有助于进一步认识藤黄酸在体内的作用机理。

3. 紫草素是传统中药紫草的主要活性成分,作为中药已经在我国使用了很久。尽管紫草素具有高效的抗肿瘤活性,但其在细胞内的靶点还不是特别清楚。我们发现紫草素可以抑制TrxR而诱导活性氧介导的HL-60细胞凋亡。紫草素主要靶向TrxR中的Sec而抑制其生理活性,同时经紫草素修饰的TrxR可以直接氧化NADPH而诱发ROS的产生,打破细胞内氧化还原态的平衡。进一步研究发现,过量表达细胞内的TrxR能够降低紫草素的细胞毒活性,而降低细胞内TrxR则可以增加细胞对紫草素的敏感性。我们的研究揭示了紫草素抗肿瘤作用的新机制,即可以通过作用于TrxR而诱导肿瘤细胞发生氧化应激介导的凋亡,这将为紫草素发展成可能的抗肿瘤药物提供理论依据。

4.小白菊内酯是来自于传统抗炎植物小白菊的主要活性成分,属于倍半萜内酯类化合物。该化合物含有一个α-亚甲基-γ-内酯环和一个环氧基团,使得其容易与蛋白的巯基发生迈克尔加成反应。体外实验证明,小白菊内酯显示强的TrxR抑制活性,通过抑伟TrxR而诱导HeLa细胞凋亡,而且降低细胞内TrxR能增加细胞对小白菊内酯的敏感性。这说明小白菊内酯抑制肿瘤细胞生长与其抑制TrxR活性直接相关。所以小白菊内酯对HeLa细胞内TrxR的抑制可以认为是其抗肿瘤效果的一种新机制。

参考文献

[1]The thioredoxin antioxidant system[J].Jun Lu,Arne Holmgren.Free Radical Biology and Medicine.2014

[2]Genistein induces apoptosis and autophagy in human breast MCF-7 cells by modulating the expression of proapoptotic factors and oxidative stress enzymes[J].R.F.Prietsch,L.G.Monte,F.A.Silva,F.T.Beira,F.A.B.Del Pino,V.F.Campos,T.Collares,L.S.Pinto,R.M.Spanevello,G.D.Gamaro,E.Braganhol.Molecular and Cellular Biochemistry.2014(1-2)

[3]Powerful tumor cell growth-inhibiting activity of a synthetic derivative of atractyligenin:Involvement of PI3K/Akt pathway and thioredoxin system[J].Roberta Cotugno,Dario Gallotta,Fabrizio Dal Piaz,Ivana Apicella,Sandro De Falco,Sergio Rosselli,Maurizio Bruno,Maria Antonietta Belisario.BBA-General Subjects.2014(3)

[4]A Chemical–Biological Evaluation of Rhodium（I）N‐Heterocyclic Carbene Complexes as Prospective Anticancer Drugs[J].Luciano Oehninger,Laura Nadine Küster,Claudia Schmidt,Alvaro Mu?oz‐Castro,Aram Prokop,Ingo Ott.Chem.Eur.J..2013(52)

[5]段东柱.以硫氧还蛋白还原酶为靶点的天然化合物抗肿瘤机制研究[D].兰州大学,2014.