人磷脂酰丝氨酸(PS)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人磷脂酰丝氨酸(PS)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆或其它相关生物液体中磷脂酰丝氨酸(PS)的含量。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用磷脂酰丝氨酸(PS)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的磷脂酰丝氨酸(PS)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗Β内酰胺酶抑制剂(BLI)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，磷脂酰丝氨酸(PS)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中磷脂酰丝氨酸(PS)的浓度。

人磷脂酰丝氨酸(PS)ELISA KIT

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于谷氨酸棒杆菌过量合成磷脂酰丝氨酸的研究

利用基因工程手段,对谷氨酸棒杆菌中合成PS代谢途径中的关键酶基因进行改造,使更多碳流量进入PS合成途径,同时对改造后的重组菌株生长情况和PS的变化进行分析,为谷氨酸棒杆菌合成PS的研究奠定基础。

（1）为增加谷氨酸棒杆菌ATCC13032（本研究简写为Cgl）中PS前体物质L-丝氨酸的含量,敲除了L-丝氨酸代谢为丙酮酸途径中的丝氨酸脱氨酶编码基因sdaA,构建获得重组菌株Cgl-1,Cgl-1总磷脂中PS含量较Cgl提高了10.43%,在单位干菌体里Cgl-1的PS含量比Cgl增加了0.46倍,达到了0.79 mg/g菌体。菌株生长并未受到影响。

（2）为增加Cgl中PS前体物质L-丝氨酸和CDP-甘油二酯的含量,分别构建了过表达3-磷酸甘油酸脱氢酶基因serAΔ591、磷酸丝氨酸转氨酶基因serC、磷酸丝氨酸磷酸酶基因serB和CDP-甘油二酯合成酶基因cdsA的重组菌株Cgl-2、Cgl-3、Cgl-4和Cgl-5,其中总磷脂中PS含量分别提高了24.34%、8.69%、7.83%和16.52%,在单位干菌体中Cgl-2 PS含量达到1.08 mg/g菌体。菌株生长并未受到影响。

（3）为进一步增加PS含量,在Cgl-1重组菌株中过表达serAΔ591、serC、serB、cdsA、E.coli K12磷脂酰丝氨酸合成酶基因pssA和心磷脂合成酶基因car,得到六个重组菌Cgl-6、Cgl-7、Cgl-8、Cgl-9、Cgl-10,其中PS占总磷脂的比例与出发菌株相比均有所增加,分别提高了35.65%、13.04%、11.30%、27.82%、30.43%,其中Cgl-6、Cgl-9和Cgl-10总磷脂中PS含量提高明显,Cgl-6单位干菌体中PS含量达到了1.34 mg/g菌体;Cgl-11菌株的PS含量没有明显发生改变。菌株生长未受到影响。

（4）在Cgl-1中串联表达serAΔ591、cdsA和pssA的重组菌株Cgl-12,其中总磷脂中PS含量较原始菌株Cgl提高了45.22%,单位干菌体中达到1.98 mg/g菌体,说明串联表达与敲除组合能有效提高谷氨酸棒杆菌PS合成量。菌株生长未受到影响。

参考文献

[1]Brain membrane lipids in major depression and anxiety disorders[J].Christian P.Müller,Martin Reichel,Christiane Mühle,Cosima Rhein,Erich Gulbins,Johannes Kornhuber.BBA-Molecular and Cell Biology of Lipids.2014

[2]Phosphatidylserine and the Human Brain[J].Michael J.Glade,Kyl Smith.Nutrition.2014

[3]Phosphatidylserine in the brain:Metabolism and function[J].Hee-Yong Kim,Bill X.Huang,Arthur A.Spector.Progress in Lipid Research.2014

[4]Combination of metabolomic and phospholipid-profiling approaches for the study of Alzheimer’s disease[J].Raúl González-Domínguez,Tamara García-Barrera,JoséLuis Gómez-Ariza.Journal of Proteomics.2014

[5]李瑞.谷氨酸棒杆菌过量合成磷脂酰丝氨酸的研究[D].天津科技大学,2016.