维生素A醋酸酯

背景技术

维生素A及其衍生物是维持人类与动物的生长与生命所不可缺少的物质之一，人体缺乏维生素A，会出现皮肤干燥、脱屑和脱发等症状。最常用的维生素A衍生物是维生素A醋酸酯，其结构式如下：

维生素A醋酸酯用于维生素A缺乏症，该维生素为脂溶性，是调节上皮组织细胞生长与健康的必须因子，使粗糙老化皮肤表面变薄，促进细胞新陈代谢正常化，祛皱效果明显。目前维生素A醋酸酯已被广泛应用于医药、食品添加剂、饲料添加剂及化妆品等行业，其制备合成一直备受关注。传统的Isler合成工艺中，维生素A使用羟基维生素A醋酸酯在有机溶剂中预冷至-55℃～-65℃，用质量浓度≥61％的氢溴酸将其羟基溴代，然后再脱溴形成共轭双键得到维生素A醋酸酯成品，其具体反应过程如下所示：

然而，采用该方法存在以下缺点：

(1)反应路线长，包括上溴、脱溴两步反应，实际工艺化生产还需多次分层萃取，操作步骤繁琐，且会产生大量废水；

(2)需使用其他多种辅料，其中高浓度的氢溴酸具有强腐蚀性，操作危险性大，且设备易被腐蚀；

(3)上溴反应需在超低温条件下反应，能耗高；

(4)整个反应过程对温度及pH值的控制要求极高，易操作失误，从而影响产品质量和外观。

发明内容

本发明针对羟基维生素A醋酸酯脱水生成维生素A醋酸酯合成方法中所存在的以上问题，而提供一种简单高效、产品收率较高、质量较好的维生素A醋酸酯的合成方法。

具体地，本发明提供了一种维生素A醋酸酯的合成方法，其中，该方法包括将羟基维生素A醋酸酯在有机溶剂中以脱水酶作为催化剂进行脱水反应，使得羟基维生素A醋酸酯脱去一份子水并形成共轭双键。

优选地，所述脱水酶产自有机体假单胞菌属、黄杆菌属、乳杆菌属、金黄杆菌属、链球菌属和芽孢杆菌属中的至少一种菌属，更优选产自嗜麦芽寡养单胞菌、嗜冷黄杆菌、植物乳杆菌、脑膜脓毒金黄杆菌、酿脓链球菌和纺锤形赖氨酸芽孢杆菌中的至少一种菌种。

优选地，所述脱水酶按照以下方法获得：通过克隆或化学合成法从所述菌属或菌种中获得酶基因，将该酶基因引入原核表达载体中得到重组载体，之后将所述重组载体转化至大肠杆菌得到重组菌株，所述重组菌株经发酵、分离纯化后得到所述脱水酶；所述酶基因的基因序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。

优选地，所述发酵的方式为将所述重组菌株在含有50～200μg/mL氨苄青霉素的培养基中于25～40℃、100～300rpm条件下震荡培养至OD600值为0.6～0.8，往菌液中加入诱导剂至终浓度为0.8～1.2mM，继续培养20～30h。

优选地，所述分离纯化的方式为将发酵菌液于0～5℃、5000～7000rpm条件下离心分离，弃去上清液，收集菌体，并将收集的菌体重新悬浮于Tris-HCl缓冲液中，超声波破碎后，于0～5℃、5000～7000rpm条件下再次离心分离，收集上层酶液，该酶液即为脱水酶。

优选地，所述脱水酶以固定化酶的形式使用，所述固定化酶包括载体材料以及吸附在所述载体材料上的脱水酶，且所述脱水酶与载体材料的重量比为(1～5)mg:1g。选地，所述脱水酶与载体材料的重量比为2mg:1g。

优选地，所述固定化酶采用将脱水酶与载体材料在室温下于摇床中固定化反应5-20小时，之后再洗涤干燥制得。

优选地，所述载体材料选自硅藻土、活性炭、多孔玻璃、硅胶和氧化铝中的至少一种，选为硅藻土。

优选地，当所述脱水酶未固定化使用时，则所述羟基维生素A醋酸酯、有机溶剂和酶的用量比为10g︰(50～150)mL:(15～50)mg；当所述脱水酶以固定化酶的形式使用时，则所述羟基维生素A醋酸酯、有机溶剂和固定化酶的用量比为10g︰(50～150)mL:(3～10)g。

优选地，所述脱水反应在减压共沸蒸馏条件下进行。

优选地，所述脱水反应的温度为20～70℃，更优选为30℃～60℃；时间为4h～10h，更优选为5h～8h。

优选地，所述有机溶剂选自C5～C8的烷烃、C5～C8的环烷烃、C1～C8的卤代烃和C6～C10的芳香烃中的至少一种。

优选地，所述C5～C8的烷烃选自正己烷、正庚烷和正戊烷中的至少一种。

优选地，所述C5～C8的环烷烃为环己烷。

优选地，所述C1～C8的卤代烃为二氯甲烷和/或1-氯己烷。

优选地，所述C6～C10的芳香烃选自苯、甲苯和二甲苯中的至少一种。

优选地，本发明提供的维生素A醋酸酯的合成方法还包括在所述脱水反应之后，将所得反应液冷却后过滤，所得滤渣作为脱水酶回用，所得滤液经减压蒸发有机溶剂之后得到维生素A醋酸酯。

优选地，所述冷却之后反应液的温度降至20℃以下。

优选地，所述减压蒸发的条件包括温度为50℃～60℃，压力为-0.060～-0.099MPa。

本发明提供的合成方法反应条件温和、能耗低、无副反应、无废水、操作简单、反应收率高，并且产品纯度高、质量好，避免了前述维生素A醋酸酯合成方法存在的缺陷。

采用本发明提供的方法合成的维生素A醋酸酯，外观为黄色油状物。采用《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法(GB/T 17817-2010)》的检测方法分析，效价＞250万IU/g，折纯收率可达92％以上，可广泛用作药物、饲料添加剂、食品添加剂等。

具体实施方式

该制备例用于说明本发明提供的脱水酶的合成。

(1)酶合成：将脑膜脓毒金黄杆菌的酶基因(由生工生物工程(上海)股份有限公司化学合成获得，所述酶基因的基因序列为SEQ ID NO:4)克隆到pET25载体内，然后将所得重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌株，将该重组菌株在含有100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基中于30℃、180rpm条件下振荡培养至OD600值为0.6-0.8，之后往菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，继续培养24h。将菌液于4℃、6000rpm离心15min，弃去上清液，收集菌体。将收集的菌体重新悬浮于Tris-HCl缓冲液(20mM Tris-HCl、300mM NaCl、pH值8.0)中，超声波破碎后，于4℃、6000rpm离心15min，收集上层酶液(5mg/ml)，保存在4℃下。

(2)酶固定化：取2mL上述酶液(5mg/ml)与5g硅藻土(使用前活化处理，即于300℃～450℃烘干2～4h，下同)混匀后置于摇床中，室温下振荡吸附12h，吸去酶液，用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)洗涤3次，于50℃真空干燥24h，即得到固定化酶。用HPLC法检测得到该固定化酶的活性为12000IU/g。