人表面膜免疫球蛋白A(MIGA)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

人表面膜免疫球蛋白A(MIGA)ELISA KIT用于检测血液、血清、胸腹水等其他体液中表面膜免疫球蛋白A(MIGA)的含量。

实验原理：人表面膜免疫球蛋白A(MIGA)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被表面膜免疫球蛋白A(MIGA)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的表面膜免疫球蛋白A(MIGA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品中表面膜免疫球蛋白A(MIGA)浓度。

人表面膜免疫球蛋白A(MIGA)ELISA KIT

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于穿山龙提取物薯蓣皂苷对人B细胞分泌Gd-IgA1的影响及其机制研究

通过体外细胞实验,深入研究穿山龙提取物薯蓣皂苷对人B细胞（DAKIKI）分泌Gd-IgA1的影响及其作用机制,以进一步证实薯蓣皂苷对IgAN的治疗作用,为中医药防治IgAN提供新的治疗思路。

方法:1.网络药理学通过网络药理学的方法,筛选出穿山龙的有效活性成分,然后预测出作用靶点,并获取IgAN的疾病作用靶点,将药物预测靶点和疾病靶点取交集,筛选出穿山龙治疗IgAN的潜在靶点。构建“穿山龙-成分-IgAN-靶点”相互作用网络图,筛选出dregee值靠前的活性成分考虑为穿山龙治疗IgAN的关键成分。再构建穿山龙中蛋白相互作用的PPI网络,最后将穿山龙和IgAN的共同靶点进行关键靶基因GO、KEGG功能富集分析。

2. 体外细胞实验观察薯蓣皂苷对人B细胞增殖和分泌Gd-IgAl的干预作用及相关指标的检测。采用稳定分泌IgA及Gd-IgA1的人B细胞（DAKIKI）作为载体,经LPS刺激后,再通过不同浓度的薯蓣皂苷干预,采用CCK8法检测各组DAKIKI细胞的增殖情况,采用ELISA法检测薯蓣皂苷对DAKIKI细胞分泌IgA及Gd-IgAl的影响,采用qRT-PCR法和Western blot法分别检测各组人B细胞DAKIKI中糖基化转移酶C1GALT1及其分子伴侣Cosmc的mRNA水平和蛋白水平。

结果:1.网络药理学:（1）通过TCMSP、BATMAN-TCM数据库筛选得到穿山龙潜在活性成分12个（其中11个涉及IgAN相关靶点及信号通路）;

（2）通过PharmMapper数据库预测出这些活性成分的作用靶点121个,通过Genecards、OMIM数据库共检索出IgAN的疾病作用靶点1346个,将药物预测靶点和疾病靶点取交集,筛选出穿山龙治疗IgAN的潜在靶点45个;

（3）将穿山龙潜在活性成分与IgAN相关的作用靶点导入Cytoscape软件进行可视化,结果表明,穿山龙中dregee值前5的潜在活性分子为Diosgenin palmitate（薯蓣皂甙元棕榈酸酯）、Delta3,5-Deoxytigogenin（Δ3,5-脱氧替告皂贰元）、Dioscin（薯蓣皂苷）、7-Epitaxol（紫杉醇）、DIOSGENIN,DEHYDRO（薯蓣皂素）。与Δ3,5-脱氧替告皂贰元相比,在中药穿山龙中薯蓣皂苷、薯蓣皂苷元占据更加重要的地位。

参考文献

[1]C1GALT1 expression is associated with galactosylation of IgA1 in peripheral B lymphocyte in immunoglobulin a nephropathy.[J].Xing Yue,Li Lina,Zhang Yaru,Wang Fanghao,He Dandan,Liu Youxia,Jia Junya,Yan Tiekun,Lin Shan.BMC nephrology.2020(1)

[2]Design,Preparation,and Characterization of Dioscin Nanosuspensions and Evaluation of Their Protective Effect against Carbon Tetrachloride-Induced Acute Liver Injury in Mice.[J].Ju Hong-Ye,Hu Kun-Xia,Zhao Guo-Wang,Tang Zhi-Shu,Song Xiao.Evidence-based complementary and alternative medicine:eCAM.2019

[3]SUN-238 IMMUNOSUPPRESSIVE AGENTS FOR TREATING IGA NEPHROPATHY:AN UPDATED COCHRANE REVIEW[J].S.Palmer,M.Ruospo,P.Natale,J.Hegbrant,G.Strippoli.Kidney International Reports.2019(7)

[4]The Emerging Role of Complement Proteins as a Target for Therapy of IgA Nephropathy.[J].Rizk Dana V,Maillard Nicolas,Julian Bruce A,Knoppova Barbora,Green Todd J,Novak Jan,Wyatt Robert J.Frontiers in immunology.2019

[5]沈佳晨.穿山龙提取物薯蓣皂苷对人B细胞分泌Gd-IgA1的影响及其机制研究[J]中国中医科学院.2022