小鼠Α葡萄糖苷酶(A-GLU)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠Α葡萄糖苷酶(A-GLU)ELISA KIT用于测定血清、血浆、组织及相关液体样本中Α葡萄糖苷酶(A-GLU)的含量或活性。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中Α葡萄糖苷酶(A-GLU)水平。用纯化的Α葡萄糖苷酶(A-GLU)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入Α葡萄糖苷酶(A-GLU)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Α葡萄糖苷酶(A-GLU)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中Α葡萄糖苷酶(A-GLU)含量。

小鼠Α葡萄糖苷酶(A-GLU)ELISA KIT

样品收集、处理及保存方法：

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：edta、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于N-乙酰转移酶性质研究、在Picha pastoris KM71/pPIC9K-αglu中共表达及重组菌株发酵过程优化研究

研究Mpr1酶学性质;以重组表达α-葡萄糖苷酶的重组P.pastoris KM71/p PIC9K-αglu为出发菌株,构建共表达Pp Mpr1重组菌株P.pastoris KM71/p PIC9K-αglu/p PICZA-MPR1,研究Mpr1对酵母细胞生长和产α-葡萄糖苷酶的影响,并进行3.6 L罐发酵优化。

主要研究结果如下:（1）以P.pastoris GS115的基因组为模板,PCR扩增获得MPR1基因,将其连接到表达载体p QE30上,构建重组菌株E.coli JM109/p QE30-MPR1,筛选获得有活性的重组菌株E.coli JM109/p QE30-MPR1并摇瓶培养,诱导发酵24 h后,酶活达到为462.32m U·m L-1。

（2）利用响应面分析法从诱导温度、IPTG诱导浓度、起始诱导OD600对重组菌株进行摇瓶发酵优化:诱导温度为30°C,IPTG浓度控制为0.4 mmol·L-1,起始诱导生物量OD600为4.5,诱导发酵24 h,酶活达到610.30±9.50 m U·m L-1。对Mpr1进行了纯化和酶学性质分析,结果显示:Mpr1的最适反应p H为7.5,最适反应温度是30°C,4-20°C条件下Mpr1具有较好的稳定性,在Mpr1中添加甘油和山梨醇一定程度上提高了酶的稳定性。

（3）将MPR1基因连接到表达载体p PICZA上,Sac I线性化后导入重组P.pastoris KM71/p PIC9K-αglu中得到重组菌株P.pastoris KM71/p PIC9K-αglu/p PICZA-MPR1。研究重组菌株在发酵过程中对酵母细胞生长和产α-葡萄糖苷酶的影响,结果显示:摇瓶培养诱导96 h,出发菌株的α-葡萄糖苷酶酶活为560 m U·m L-1,重组菌株酶活为1,080 m U·m L-1,是出发菌株的1.93倍。诱导134 h和158 h重组菌株细胞死亡率比出发菌株分别降低了24%和61%。在不同溶氧条件下,3.6 L罐诱导发酵160 h,重组菌株细胞死亡率和胞内ROS含量比出发菌株低,重组菌株的α-葡萄糖苷酶最高酶活比出发菌株提高了40%,比活提高了34%。

（4）3.6 L发酵罐进行重组菌株P.pastoris KM71/p PIC9K-αglu/p PICZA-MPR1发酵优化,确立了产α-葡萄糖苷酶的发酵条件为:初始诱导OD600为100、p H为5.0、溶氧浓度35%、诱导温度30°C、甲醇诱导浓度为0.5%（v/v）,诱导160 h,酶活高达16,270mUm L-1,发酵水平显著提高,是目前报道的较高水平。

参考文献

[1]High efficient production of recombinant human consensus interferon mutant in high cell density culture of Pichia pastoris using two phases methanol control[J].Dan Wu,Ju Chu,Yu-You Hao,Yong-Hong Wang,Ying-Ping Zhuang,Si-Liang Zhang.Process Biochemistry.2011(8)

[2]Antioxidant N-acetyltransferase Mpr1/2 of industrial baker’s yeast enhances fermentation ability after air-drying stress in bread dough[J].Yu Sasano,Shunsuke Takahashi,Jun Shima,Hiroshi Takagi.International Journal of Food Microbiology.2010(1)

[3]Functional Oligosaccharides:Application and Manufacture[J].R.A.Rastall.Annual Review of Food Science and Technology-（new in 2010）.2010

[4]Incomplete formation of intramolecular disulfide bond triggers degradation and aggregation of human consensus interferon-αmutant by Pichia pastoris[J].Dan Wu,Dong Ma,Yu-You Hao,Ju Chu,Yong-Hong Wang,Ying-Ping Zhuang,Si-Liang Zhang.Applied Microbiology and Biotechnology.2010(6)

[5]朱海峰.N-乙酰转移酶性质研究、在Picha pastoris KM71/pPIC9K-αglu中共表达及重组菌株发酵过程优化研究[D].江南大学,2015.