小鼠血纤蛋白原(FBG)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠血纤蛋白原(FBG)ELISA KIT用于测定血清、血浆、组织及相关液体样本中血纤蛋白原(FBG)的含量或活性。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中血纤蛋白原(FBG)水平。用纯化的血纤蛋白原(FBG)捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入血纤蛋白原(FBG)，再与HRP标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的甲状旁腺激素(PTH)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中血纤蛋白原(FBG)含量。

小鼠血纤蛋白原(FBG)ELISA KIT

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

应用^[4][5]

用于吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达及纯化研究

吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Bat-PA），来源于南美洲吸血蝙蝠（Desmodus rotundus）的唾液，是一种t-PA类似物。该类似物共有四种形式，分别为：DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ、DSPAγ，其中对DSPAα1（Bat-PA（H））的研究最多，其纤溶活性也最高，DSPAα1是由477个氨基酸组成的高分子蛋白，与t-PA分子有85％的同源性，区别在于它不具有t-PA分子的kringle 2区和纤溶酶切割位点。与t-PA相比较，DSPAα1的血纤蛋白依赖性和选择特异性更高。

当血纤蛋白存在时，DSPAα1的催化活性提高45000倍，而t-PA仅提高205倍。动物实验证明，重组的Bat-PA的溶栓速度比重组的t-PA更快，对血栓中血纤蛋白选择性更强，持续的时间更长。同时，在给药后，Bat-PA致使血纤蛋白原、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶下降的比例都明显低于t-PA，还发现t-PA用药后有高分子质量的血纤蛋白原降解产物片段的积累，而Bat-PA用药后不发生这类片段的积累。

关于纤溶酶原和因子Ⅷ的变化，也表明t-PA导致其下降，而Bat-PA不明显。这些实验特征都显示Bat-PA极有可能开发成为一种溶栓速度快、血栓选择性高、出血副作用小的新型纤溶酶原激活剂类溶栓药物。

目前，Bat-PA主要来自哺乳动物细胞的表达，如中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、幼仓鼠肾细胞（BHK）、非洲绿猴肾细胞（COS），其代价昂贵，表达量也偏低。希望利用毕赤酵母表达系统对Bat-PA进行生产，降低其成本，提高产率，为使Bat-PA成为急性中风的一种候选药物作初步的探索。

在体外人工合成吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂Bat-PA（H）的全长基因，并在基因序列5′和3′端分别引入His6，再将其克隆到表达载体pPIC9K上，成功构建出His6-Bat-PA／pPIC9K和Bat-PA-His6／pPIC9K重组质粒。

然后，将构建的重组质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，经过G418浓度梯度抗性筛选、小量表达后经SDS-PAGE电泳检测及纤溶平板测活，获得高拷贝高表达的Bat-PA酵母菌株。

利用单一实验和正交实验对Bat-PA酵母菌株的发酵过程中的五个因素（发酵液pH、甲醇补加量、发酵密度、发酵时间、通气量）进行优化，获得一个较优的发酵表达条件：pH=5.5，补加甲醇量2.0％／24h，4：1接种，96小时发酵，10／50通气量。通过甲醇诱导分泌型表达获得重组的带His-tag的Bat-PA蛋白，其分子量约为66KD。由于His-tag的存在，经过Ni2亲和层析柱纯化，最终可从每升发酵液中获得20-30mg目的蛋白，并利用纤溶平板法对纯化得到的蛋白进行纤溶活性分析。

参考文献

[1]Understanding the enzymology of fibrinolysis and improving thrombolytic therapy[J].Colin Longstaff,Craig Thelwell.FEBS Letters.2005(15)

[2]Vampire Bat Salivary Plasminogen Activator（Desmoteplase）Inhibits Tissue-Type Plasminogen Activator-Induced Potentiation of Excitotoxic Injury[J].Courtney Reddrop,Randal X.Moldrich,Philip M.Beart,Mark Farso,Gabriel T.Liberatore,David W.Howells,Karl-Uwe Petersen,Wolf-Dieter Schleuning,Robert L.Medcalf.Stroke.2005(6)

[3]Coronary Thrombolysis With Desmodus Salivary Plasminogen Activator in Dogs:Fast and Persistent Recanalization by Intravenous Bolus Administration[J].Werner Witt,Bernhard Maass,Berthold Baldus,Michael Hildebrand,Peter Donner,Wolf-Dieter Schleuning.Circulation.1994(1)

[4]Effective Thrombolysis Without Marked Plasminemia After Bolus Intravenous Administration of Vampire Bat Salivary Plasminogen Activator in Rabbits[J].Stephen J.Gardell,Denise R.Ramjit,Inez I.Stabilito,Tsuneo Fujita,Joseph J.Lynch,Gregory C.Cuca,Deepak Jain,Shiping Wang,Jwu-sheng Tung,George E.Mark,Ronald J.Shebuski.Circulation.1991(1)

[5]苏畅.吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂在毕赤酵母中的表达及纯化研究[D].西南大学,2007.