小鼠牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)ELISA KIT用于测定人血清、血浆及相关液体样本小肠碱性磷酸酶(CIAP)含量。

实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中碱性磷酸酶(CIAP)水平。用纯化的碱性磷酸酶(CIAP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入碱性磷酸酶(CIAP)，再与HRP标记的碱性磷酸酶(CIAP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的碱性磷酸酶(CIAP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中碱性磷酸酶(CIAP)浓度。

小鼠牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)ELISA KIT

准备试剂与收集血样

1.收集标本：血清、血浆（EDTA、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。正常标本测定前用标本稀释液作1：1 0稀释（取2 0ul，加标本稀释液18 0ul,稀释1 0倍）。

2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成2 0 000U/ml的溶液。设标准管8管，管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入2000 0 U/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。

3.10×标本稀释液用蒸馏水作1:1 0倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。

4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。

2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3.每孔中加入抗体工作液10 0ul。将反应板充分混匀后置37℃6 0分钟。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃3 0分钟。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8.每孔加入100ul终止液混匀。

9.30分钟内用酶标仪在45 0 nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.以标准品20 00、100 0、500、250、125、62.5、31.2、0 U/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应OLab含量，再乘上稀释倍数1 0即可。

应用^[4][5]

用于碱性磷酸酶—孔雀绿定磷法筛选磷酸二酯酶4抑制剂研究

在大肠杆菌中表达麦芽糖结合蛋白融合的人环核苷酸磷酸二酯酶4B2（MBP-hPDE4B2）。pMAL-p2x-PDE4B2质粒转化大肠杆菌BL21在18℃诱导16h后,产生可溶性MBP-hPDE4B2。MBP-hPDE4B2经直链淀粉树脂一步纯化后纯度达到35%。

用所建立的偶联碱性磷酸酶的孔雀绿定磷法测得此PDE4的Km为9.2±0.4μM（n=5）,其对rolipram和锌离子很敏感,比活性可达0.1 U·mg-1,有望用于PDE4抑制剂筛选。用孔雀绿定量小牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）作用于环核苷酸磷酸二酯酶4（PDE4）产物AMP释放的无机磷酸,建立测定PDE活性的光度法并尝试用于筛选PDE4抑制剂。

在孔雀绿定磷反应体系先加入钼酸铵,再加入孔雀绿显色。定磷体系终浓度2%的甘油可稳定孔雀绿和磷钼杂多酸复合物,其在630nm的吸收与磷酸浓度成比例,并可以耐受PDE4反应体系除了罂粟碱外常见物质的干扰。在PH 7.4和0.20 mM EDTA存在下,碱性磷酸酶对AMP的米氏常数（Km）为12.0±2.1μM（n=3）。在偶联CIAP的终点法中,用终浓度为5%的高氯酸终止PDE4和CIAP作用后用孔雀绿结合法测定无机磷生成量。PDE4反应体系含10.0 mM MgCl2和0.10 mM EDTA,以及30.0 U.L?1 CIAP。此条件下,反应达到稳态延迟时间一般在1.0 min以内;30 min内释放无机磷酸的速度对PDE4量在很宽范围内成线性响应。

因此,此碱性磷酸酶偶联的孔雀绿定磷法有望用于筛选对孔雀绿定磷法无干扰的PDE抑制剂。用此法成功测定了MBP-hPDE4的Km,rolipram对此hPDE4的抑制常数为11 nM。在酶标板中用定磷法要求所用酶蛋白尽量少,以便用高氯酸终止反应后不需离心去蛋白就能定量无机磷酸。

用联苯胺对高比活性CIAP抑制为模型,结果发现只要所用靶酶量足够少使反应体系的蛋白浓度足够低,此孔雀绿定磷法可不离心去蛋白就能测定磷酯水解酶活性,从而可建立磷酯水解酶抑制剂的高通量筛选系统。因此,获得高比活性重组PDE同工酶,此碱性磷酸酶-孔雀绿定磷法对筛选各种PDE以及其它磷脂酶的选择性抑制剂有明确意义。

参考文献

[1]The measurement of cyclic nucleotide phosphodiesterase 4 activities via the quantification of inorganic phosphate with malachite green[J].Sha Zhu,Zhiyong Gan,Zhirong Li,Yin Liu,Xiaolan Yang,Ping Deng,Yanlin Xie,Mingan Yu,Hong Liao,Yunsheng Zhao,Lina Zhao,Fei Liao.Analytica Chimica Acta.2009(1)

[2]New targets for drug development in asthma[J].Ian M Adcock,Gaetano Caramori,K Fan Chung.The Lancet.2008(9643)

[3]Determination of phosphate using a highly sensitive paired emitter–detector diode photometric flow detector[J].Martina O’Toole,King Tong Lau,Roderick Shepherd,Conor Slater,Dermot Diamond.Analytica Chimica Acta.2007(2)

[4]Phosphodiesterase-4 inhibitors as a novel approach for the treatment of respiratory disease:cilomilast[J].Kroegel,Foerster.Expert Opinion on Investigational Drugs.2007(1)

[5]朱莎.碱性磷酸酶—孔雀绿定磷法筛选磷酸二酯酶4抑制剂[D].重庆医科大学,2009.