小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆或其它相关生物液体中小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)的含量。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)的浓度。

小鼠胚胎干细胞系MESPU30(M30)ELISA KIT

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断与分析：

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的指标标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度,再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

应用^[4][5]

用于小鼠胚胎干细胞培养及神经分化的研究

1．剪刀切割结合针头挤压小鼠胎儿组织能有效获得均匀、大小适中并容易贴壁生长的小组织块。将这些组织块培养48h，大量的梭形细胞从贴壁小组织块的边缘游离出的，细胞密度大，细胞生长旺盛，很快形成原代小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）单层。MEF用5μg／ml的丝裂霉素处理2.5-4h，10μg／ml的丝裂霉素处理1-4h或20μg／ml的丝裂霉素处理1-2.5h均可有效抑制其分裂，并保持细胞的正常活力；用14、21、28GRAY的γ射线处理，亦可有效抑制MEF的分裂，保持细胞的正常活力。

2．小鼠ES细胞解冻后，在饲养层培养体系用含LIF（1000U／ml）的完全培养液培养48h时，ES细胞形成边界清晰光滑的克隆，克隆内细胞排列紧密，难以辩认单个细胞，克隆边缘未见分化细胞；此时Oct-4细胞表达强烈的Oct-4-GFP绿色荧光，RT-PCR检测到细胞有高水平的Oct-4 mRNA，碱性磷酸酶AKP反应结果呈强阳性，表明细胞处于良好的未分化形态。如果在无饲养层培养体系培养48h，ES细胞出现了不同分化程度的克隆形态，表明饲养层能较好地控制ES细胞复苏时分化的发生。

3．将在饲养层培养体系中已培养2-3代的ES细胞接种于有饲养层及预铺了0.1％明胶（无饲养层）的96孔板中培养，在培养液中添加1000，1500，2000IU／ml的LIF能显著提高ES细胞的阳性度（有饲养层培养：17.80±3.26，19.58±3.19，21.8±3.17 vs 2.69±0.26；无饲养层培养：14.14±2.35，17.87±2.38，19.21±2.92 vs 0.016±0.0005，p＜0.01）及克隆形成率（有饲养层培养：29.1％，31.8％，33.5％vs 6.5％：无饲养层培养：24.7％，27.8％，31.2％vs 0.8％，p＜0.01）；但不同浓度LIF之间的阳性度及克隆形成率差异不显著（p＞0.05）。当不添加LIF时，饲养层培养法能显著地地提高ES细胞的AKP阳性度及克隆形成率（2.69±0.26 vs 0.016±0.0005；6.5％vs 0.8％，p＜0.01）。说明饲养层细胞在ES细胞的分化抑制中有一定作用，而起主导作用的是外源LIF。

4．培养液种类及添加谷氨酰胺、丙酮酸钠和非必需氨基酸对ES细胞体外培养的效果影响较小，而培养用水和血清品质对ES细胞体外培养的效果影响较大。Milli-Q水经亚沸处理能显著提高ES细胞保持未分化状态的能力，优质胎牛血清能提高ES的AKP阳性度和克隆形成率。

参考文献

[1]Leukaemia inhibitory factor is identical to the myeloid growth factor human interleukin for DA cells.Moreau J F,Donaldson D D,Bennett F,et al.Nature.1988

[2]A strain-independent postnatal neurodegeneration in mice lacking the EGF receptor.Sibilia M,Steinbach JP,Stingl L,et al.EMBO Journal.1998

[3]CNS stem cells:where’s the biology（a.k.a.beef）.Weiss S,van der Kooy D.Journal of Neurobiology.1998

[4]An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.Wharton KA,Ray RP and Gelbart WM.Development.1993

[5]蒙超衡.小鼠胚胎干细胞培养及神经分化的研究[D].广西大学,2004.