小鼠胆固醇酯转移蛋白(CETP)ELISA KIT的应用

背景^[1-3]

小鼠胆固醇酯转移蛋白(CETP)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆或其它相关生物液体中小鼠胆固醇酯转移蛋白(CETP)的浓度。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗小鼠胆固醇酯转移蛋白(CETP)抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的小鼠胆固醇酯转移蛋白(CETP)会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗人胃动素(MTL)抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，小鼠胆固醇酯转移蛋白(CETP)浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中小鼠胆固醇酯转移蛋白(CETP)的浓度。

小鼠胆固醇酯转移蛋白(CETP)ELISA KIT

标本要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作流程

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ调节肝脏胆固醇酯转运蛋白表达并促进胆固醇外输研究

探讨了抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ是否能通过调节肝脏中的CETP表达而影响体内胆固醇的代谢及其调控CETP的可能作用机制。

发现在人源肝细胞系HepG2细胞中通过Etoposide和Teniposide抑制拓扑异构酶Ⅱ或者用siRNA抑制拓扑异构酶Ⅱ的表达均能够明显诱导CETP的蛋白表达和分泌。与此同时,抑制拓扑异构酶Ⅱ还能够诱导CETP mRNA的表达,并增加CETP启动子的活性。

这说明Etoposide和Teniposide能够在转录水平上诱导CETP表达。当用siRNA抑制LXR表达时发现,在LXR被抑制时Etoposide和Teniposide无法发挥对CETP的诱导作用,说明拓扑异构酶Ⅱ抑制剂对CETP的诱导作用是依赖于LXR的存在。

进一步对这种诱导作用的机制进行研究并发现,Etoposide和Teniposide能够诱导LXRα的总蛋白表达,并促进LXRα和LXRβ的核转移。此外,还发现Etoposide和Teniposide还能够下调LXR转录抑制因子RIP140的表达。

因此,Etoposide和Teniposide是通过激活LXR通路来促进CETP表达激活的。在体内实验中,用Teniposide皮下注射CETP转基因小鼠,发现Teniposide能够在一定程度上改善小鼠的血脂水平,并诱导小鼠肝脏CETP的表达。

在体内胆固醇外流实验中还发现Teniposide能够显著促进CETP转基因小鼠体内的胆固醇外流。

综上所述,研究证实了DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂Etoposide和Teniposide能够诱导胆固醇代谢的重要载脂蛋白CETP表达,体内CETP的表达能够进一步促进胆固醇的逆转运,从而降低体内外周组织胆固醇水平,降低动脉粥样硬化的风险。我们的工作揭示了拓扑异构酶Ⅱ抑制剂在脂代谢调控方面的新功能,也为该类药物在动脉粥样硬化防治领域的研究应用提供了新的理论依据。

参考文献

[1]NaoXinTong Inhibits the Development of Diabetic Retinopathy in d b/d b Mice[J].Mengyang Liu,Quan Pan,Yuanli Chen,Xiaoxiao Yang,Buchang Zhao,Lifu Jia,Yan Zhu,Jihong Han,Xiaoju Li,Yajun Duan,Kuzhuvelil B.Harikumar.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine.2015

[2]Future of Cholesteryl Ester Transfer Protein Inhibitors[J].Daniel J.Rader,Emil M.deGoma.Annual Review of Medicine.2014

[3]Danhong Injection Inhibits the Development of Atherosclerosis in Both Apoe?/?and Ldlr?/?Mice[J].Yuanli Chen,Mengyang Liu,Tao Zhao,Buchang Zhao,Lifu Jia,Yan Zhu,Boli Zhang,Xiumei Gao,Guangliang Li,Xiaoju Li,Rong Xiang,Jihong Han,Yajun Duan.Journal of Cardiovascular Pharmacology.2014(5)

[4]Decreased cholesterol efflux capacity in patients with low cholesteryl ester transfer protein plasma levels[J].Hubert Scharnagl,Christina Heuschneider,Sabrina Sailer,Marcus E.Kleber,Winfried M?rz,Andreas Ritsch.Eur J Clin Invest.2014(4)

[5]刘梦扬.抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ调节肝脏胆固醇酯转运蛋白表达并促进胆固醇外输[D].南开大学,2015.