刚果红染色法

背景技术

现有微生物实验中筛选产生纤维素酶细菌的染色方法是在长出菌落的培养基上覆盖浓度为1 mg/mL的刚果红溶液，浸泡10〜15分钟或更长时间，然后倒去刚果红溶液，再加入浓度为1mol/L的氯化钠溶液浸泡15分钟或更长时间，然后倒掉氯化钠溶液，此时，能够产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈。该刚果红染色法特指纤维素染色法，凡是能产生纤维素酶的微生物均可用此方法鉴定。现有技术中如果刚果红浓度低，染色时间短的话，染不上颜色，浸泡时间短的话，透明圈不明显，因此，现有方法因使用的刚果红浓度低，需要很长时间才能染上颜色，同时浸泡洗脱时间也过长，染色和浸泡时间过长，会使菌落弥散，菌落之间发生混杂，容易交叉污染，既延长了实验时间，也有可能给实验造成不必要的麻烦，如果染色过程中菌落弥散的厉害，不同菌落之间有交叉，就必须在染色之前，将菌落转移出去，再进行染色筛选，步骤繁琐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是:提供一种能够缩短染色和浸泡时间，降低菌落之间发生混杂，减少交叉污染机会的刚果红染色法。

本发明的技术解决方案是:种刚果红染色法，其步骤是:

(1)涂布接种细菌:在羧甲基纤维素钠琼脂平板培养基上涂布接种细菌，将涂布有细菌的平板培养基放入恒温培养箱，在温度28°c的条件下培养，直至长出形态清晰的单个菌落；

(2)菌落标记:选择菌落密度合适的平板培养基，根据菌落形态标记出目标菌落；

(3)染色:在长出菌落的平板培养基上，用浓度为2〜5mg/mL的刚果红溶液浸泡平板培养基，浸泡0.5〜I分钟后去掉刚果红溶液；

(4)冲洗和浸泡:加入浓度为I mol/L的氯化钠溶液冲洗平板培养基I〜3次，再用浓度为I mol/L的氯化钠溶液浸泡平板培养基3〜5分钟，然后倒掉氯化钠溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现淡黄色的透明圈。

第二种刚果红染色法，其步骤是:

(1)点种细菌:在羧甲基纤维素钠琼脂平板培养基上点种细菌，将点种细菌的平板培养基放入恒温培养箱，在温度28 °C的条件下培养，直至长出单个菌落。

(2)染色:在长出菌落的平板培养基上，用浓度为2〜5mg/mL的刚果红溶液浸泡平板培养基，浸泡0.5〜1分钟后去掉刚果红溶液；

(3)冲洗和浸泡:加入浓度为I mol/L的氯化钠溶液冲洗平板培养基1〜3次，再用浓度为I mol/L的氯化钠溶液浸泡平板培养基3〜5分钟，然后倒掉氯化钠溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现淡黄色的透明圈。

上述羧甲基纤维素钠琼脂平板培养基的配置方法是:

(1)称取羧甲基纤维素钠2克，酵母粉5克，琼脂18克；

(2)溶解:用陈海水1000毫升将步骤(I)称取的物质溶解得到羧甲基纤维素钠琼脂溶液；

(3)灭菌:将羧甲基纤维素钠琼脂溶液用高压灭菌锅在高温高压环境下灭菌；

(4)倾倒平板培养基:将灭菌后的羧甲基纤维素钠琼脂溶液倾倒平板培养基。

上述浓度为2〜5mg/mL的刚果红溶液为质量体积比，即在100毫升的水里面加0.2〜0.5克的刚果红。

本发明的技术效果是:本发明将刚果红的浓度至少提高到2 mg/mL，同时增加氯化钠溶液冲洗的步骤(冲洗I〜3次)，使染色时间从现有技术需要的十几分钟，甚至几十分钟，缩短到本发明染色时间0.5〜I分钟，大幅度缩短染色时间；氯化钠溶液冲洗步骤的增加使浸泡脱色的时间从现有技术需要几十分钟缩短到约5分钟，大幅度缩短浸泡的时间，而且透明圈清晰。本发明染色和浸泡时间的缩短减少了菌落的弥散，降低了交叉污染的可能性。也就是说染色和浸泡时间的缩短，使得菌落在液体里浸泡的时间缩短，菌落的弥散被控制在最小程度，降低了交叉污染的可能性(不同菌落之间混合在一起)。另外，本发明菌落不会发生弥散，也就不必有转移的步骤，可以直接进行分离纯化，程序简化。

染色方法

为涂布接种培养的刚果红染色法，其步骤是:

(I)涂布接种细菌:在羧甲基纤维素钠琼脂平板培养基(纤维素酶筛选培养基)上涂布接种产生纤维素酶的细菌，如芽孢杆菌、白色瘤胃球菌、热纤梭菌，将涂布有细菌的羧甲基纤维素钠琼脂平板培养基放入恒温培养箱，在温度28°C的条件下培养，约5天长出形态清晰的单个菌落。

羧甲基纤维素钠琼脂平板培养基具体制作步骤:步，称量:称取羧甲基纤维素钠2克，酵母浸粉5克，琼脂18克；第二步，溶解:用陈海水1000毫升将上述物质一起溶解得到羧甲基纤维素钠琼脂溶液。第三步，将羧甲基纤维素钠琼脂溶液用高压灭菌锅在高温高压环境下灭菌，本实施例高温高压环境为:压力103.4kPa(l.05kg/cm2)，温度121.3° C，维持15〜20分钟。第四步，将灭菌后的羧甲基纤维素钠琼脂溶液倾倒平板，即:将装有灭菌培养基的三角烧瓶倾斜，往培养皿中倒入15〜20ml培养基，然后置于平面上冷却，即得到所需平板培养基。

本发明陈海水是指不被陆上污物污染或很少混有淡水的海域取来的海水装入玻璃瓶，并储放在暗处数星期后(7天及以上)形成的海水。陈海水可以去除一些杂质及悬浮颗粒。

涂布接种培养是用涂布棒在羧甲基纤维素钠琼脂平板上涂布所接种的细菌，筛选出目的细菌，需要筛选海水里能够产生纤维素酶的活性菌株，就取海水，稀释到每个直径为9cm的平板上有30〜300个菌落生长。本实施例是用灭菌海水稀释，然后在羧甲基纤维素钠琼脂平板上涂布稀释后的海水。本实施例灭菌海水为直接取陈海水进行高压灭菌(压力103.4kPa，温度121.3。C，维持15〜20分钟)即可。

 (2)标记菌落:选择菌落密度合适的平板，一般选择在直径9cm的平板上有20〜30个菌落，或更少，这样可以缩小筛选范围，然后根据菌落形态标记出目标菌落，特征明显不同的菌落都需要标记，例如，不同颜色的菌落，表面是否光滑的菌落等等。而那些看上去分辨不出来的菌落则不用标记，例如，两个菌落从形态，颜色，大小，表面特征均一样，则认为两个菌落是一种细菌，只标记一个菌落。标记是用记号笔将目标菌落圈起来。

(3)染色:在长出菌落的平板培养基(羧甲基纤维素钠琼脂平板)上，浸泡浓度为0.2%〜0.5%的刚果红溶液，浸泡0.5〜I分钟后，倒去刚果红溶液(即将培养皿倾斜，即可将刚果红溶液倒掉)；这里浓度为0.2%〜0.5%的刚果红溶液是重量体积比，即10mL蒸馏水里面加0.2g〜0.5g刚果红，折算后浓度为2mg/mL〜5mg/mL。本实施例采用浓度为0.2%(2mg/mL)的刚果红溶液，浸泡时间为半分钟(30秒)。浸泡是将菌落全部浸泡。

(4)冲洗和浸泡:加入浓度为1mol/L的氯化钠溶液冲洗1〜3次:本实施例冲洗是用装有氯化钠溶液的瓶子直接倒入可以覆盖整个平板培养基的氯化钠溶液，再将平板培养基倾斜，将溶液倒出去，再重复I〜2次即可，然后再用浓度为I mol/L的氯化钠溶液覆盖浸泡3〜5分钟，然后倒掉氯化钠溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现淡黄色的透明圈。

本实施例加入浓度为1mol/L的氯化钠溶液冲洗2次，再覆盖氯化钠溶液浸泡4分钟，然后倒掉氯化钠溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现淡黄色的透明圈。

本实施例浓度为1mol/L的氯化钠溶液配制方法:步，计算:氯化钠(NaCl)物质的量=1mol/LX IL=1mol,由氯化钠摩尔质量58.5g/mol,则氯化钠质量=1mol X 58.5g/mol=58.5g。第二步，称量:用分析天平称量58.5g。第三步，溶解:在烧杯中用50ml蒸馏水使称取的氯化钠完全溶解，并用玻璃棒搅拌。第四步，转移:把溶解好的溶液移入10ml容量瓶。第五步，定容:加蒸馏水到接近刻度2〜3厘米时，改用胶头滴管加蒸馏水到刻度。第六步，摇匀:定容后的溶液浓度不均匀，要把容量瓶用瓶塞塞紧，用食指顶住瓶塞，用另一只手的手指托住瓶底，把容量瓶倒转和摇动多次，使溶液混合均匀，即把定容后的氯化钠溶液摇匀。把配制好的溶液倒入试剂瓶中，盖上瓶塞，贴上标签备用。