人性激素结合球蛋白(SHBG)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人性激素结合球蛋白(SHBG)ELISA试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆或其它相关生物液体中SHBG浓度。

检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗人SHBG抗体包被于酶标板上，实验时样品（或标准品）中的人SHBG会与包被抗体结合，游离的成分被洗去，然后依次加入生物素化的抗人SHBG抗体，HRP-链霉亲和素结合物,最后加入单组份TMB底物液。TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，SHBG浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中SHBG的浓度。

人性激素结合球蛋白(SHBG)ELISA试剂盒

样品收集:

1.血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2.血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟，取上清即可检测。避免使用溶血，高血脂样品。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养上清：取细胞培养上清于1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。

操作步骤：

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育5分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断与分析：

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的指标标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度,再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

应用^[4][5]

用于性激素、性激素结合球蛋白（SHBG）、及其联合效应对2型糖尿病风险的预测作用研究

探索性激素、性激素结合球蛋白（SHBG）、及其联合效应对2型糖尿病风险的预测作用。

研究方法:在环境、炎症和代谢性疾病研究（EIMDS）（2008-13）中开展前瞻性巢式病例对照研究。基线时共纳入3510例未患糖尿病的受试者,随访5年后共有145例男性和87例绝经后女性进展为2型糖尿病。

随机选择年龄、性别匹配的糖耐量正常受试者作为对照组。将基线SHBG、雌二醇、睾酮、脱氢表雄酮的浓度划分为三分位,受试者与之对应划分为低、中和高暴露水平。利用相关性分析观察性激素血空腹血糖、OGTT 2小时血糖的相关性;利用多元回归模型计算性激素、SHBG以及性激素和SHBG的联合效应对2型糖尿病的预测作用。研究结果:在男性和女性,基线SHBG水平与空腹血糖变化值、OGTT 2小时血糖变化值均显著负相关;在男性,基线雌二醇水平与空腹血糖变化值、OGTT 2小时血糖变化值均显著正相关;基线睾酮水平与空腹血糖变化值、OGTT 2小时血糖变化值均显著负相关;在女性,基线SHBG水平与空腹血糖变化值、OGTT 2小时血糖变化值均显著负相关。

多元回归模型校正年龄、性别、BMI等混杂因素后,基线低SHBG水平的男性比高SHBG水平的男性患2型糖尿病的风险增加4倍;高雌二醇水平的男性比低雌二醇水平的男性患2型糖尿病的风险增加四倍。

联合效应分析显示低SHBG+高雌二醇水平的男性比高SHBG+低雌二醇水平的男性患2型糖尿病的风险增加20倍[OR20.23;95%可信区间（CI）4.62-51.33]。在男性受试者中,睾酮、脱氢表雄酮不能独立预测2型糖尿病的发生;睾酮或脱氢表雄酮联合SHBG与2型糖尿病的发生风险亦无相关性。在女性受试者中,随着SHBG水平增高,患2型糖尿病的风险显著降低[OR 0.92（95%CI 0.21-4.53）,0.14（95%CI 0.10-0.74）;P=0.043];雌二醇、睾酮和脱氢表雄酮单独或联合SHBG均与2型糖尿病的发病风险无关。

结论:男性和女性体内的SHBG是2型糖尿病的独立保护因素;男性雌二醇是2型糖尿病的独立危险因素;低SHBG与高雌二醇的联合作用可以预测男性2型糖尿病的发生。

参考文献

[1]Sex Steroid Actions in Male Bone[J].Dirk Vanderschueren,Micha?l R.Laurent,Frank Claessens,Evelien Gielen,Marie K.Lagerquist,Liesbeth Vandenput,Anna E.B?rjesson,Claes Ohlsson.Endocrine Reviews.2014(6)

[2]Combined effect of physical activity and leisure time sitting on long-term risk of incident obesity and metabolic risk factor clustering[J].Joshua A.Bell,Mark Hamer,G.David Batty,Archana Singh-Manoux,Séverine Sabia,Mika Kivimaki.Diabetologia.2014(10)

[3]Effect of Testosterone Treatment on Glucose Metabolism in Men With Type 2 Diabetes:A Randomized Controlled Trial[J].Gianatti,Emily J,Dupuis,Philippe,Hoermann,Rudolf,Strauss,Boyd J,Wentworth,John M,Zajac,Jeffrey D,Grossmann,Mathis.Diabetes Care.2014(8)

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[5]张皑频.性激素、性激素结合球蛋白（SHBG）、及其联合效应对2型糖尿病风险的预测作用[D].重庆医科大学,2017.