A群脑膜炎IGG抗体测定试剂盒的应用

背景^[1-3]

A群脑膜炎IGG抗体测定试剂盒在微孔条上预包被经特殊处理的A群脑膜炎球菌多糖，配以酶标记抗人IgG结合物及TMB显色剂等其它试剂，采用间接酶联免疫法原理检测人血清或血浆中的A群脑膜炎球菌多糖抗体(IgG)的含量。

A群脑膜炎IGG抗体测定试剂盒

操作步骤：

1、配液：将50ml浓缩洗涤液（20×）用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用，此洗涤液同时作为稀释液使用。

2、参比品的稀释:每支冻干参比品溶于0.5 ml稀释液，即为1.0μg/ml。将参比品稀释为0.12μg/ml、0.10μg/ml、0.08μg/ml、0.06μg/ml、0.04μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml、0.005μg/ml浓度的系列，备用。

3、样品稀释：先将样品作1∶100稀释（精确取10μl血清加入990μl洗涤液中混匀）备用。

4、加样：第1行（空白对照A1）和阴性、阳性对照孔（各1~2孔）、参比品各浓度的孔不加稀释液。每份待检标本做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800四个稀释度。

5、参比品加样：将8个稀释度的参比品各取100μl加到酶标板相应的孔内。空白对照孔不加样品。

6、阳性对照、阴性对照各加1-2孔，每孔100μl。

7、置37℃孵育60分钟。

8、洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤4遍，甩干。

9、加酶：每支冻干抗人IgG酶结合物溶于0.2ml洗涤液，完全溶解后用洗涤液作1∶120倍稀释。每孔（包括空白对照孔）加入已稀释酶标试剂100μl，置37℃孵育30分钟。

10、洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，甩干。

11、显色：显色剂A、B液等体积混匀后每孔加入100μl，37℃避光显色10分钟，之后每孔加终止液50μl。

12、测定：设定酶标仪波长为450nm（建议用双波长检测参比波长≥600nm），用空白孔调零点后测定各孔吸光值。

结果判定：

1、阳性对照A450nm>0.50，阴性对照A450nm＜0.20试验成立。

2、以标准品抗体浓度作为横坐标、吸光值作为纵坐标作直线回归方程，方程式为y=a+bx。

3、将待检样品的吸光值(y)代入方程中计算出不同稀释度时血清样品的抗体含量（Xμg/ml）。

4、将抗体含量乘以对应的样品稀释度求出血清抗体含量的均值。

5、样品吸光值超出直线回归方程范围的吸光值不得代入方程计算抗体含量。

6、计算样品抗体含量时，选择样品吸光值在0.3~1.0之间的代入方程式，此时计算结果较为真实。

应用^[4][5]

用于B群脑膜炎球菌外膜蛋白复合物免疫原性初探研究

B群脑膜炎奈瑟氏球菌是引起流行性脑脊髓膜炎的主要病原菌,其血清型别众多,型间缺乏交叉免疫保护。B群脑膜炎球菌疫苗的研发多集中在外膜蛋白（OMPs）及外膜囊（OMV）。自然状态的OMV由完整的外膜组成,包括外膜蛋白（OMP）和脂寡糖（LOS）。这些成分很容易通过去垢剂溶解直接从菌体上获得。

脑膜炎奈瑟氏菌体表面的蛋白质,依据分子量可分成5类,其Ⅰ类蛋白是阳离子选择性孔蛋白,能够诱导杀菌抗体的产生;Ⅱ类、Ⅲ类蛋白是阴离子选择性孔蛋白,在一种菌上不能同时表达,抗Ⅱ/Ⅲ类蛋白的抗体只是偶尔具有保护和杀菌活性;Ⅳ类蛋白的功能尚不清楚,可能参与了孔道的形成,抗Ⅳ类蛋白抗体能够抑制特异的抗Ⅰ类及Ⅱ/Ⅲ类蛋白抗体的杀菌活性,从而大大降低细菌的免疫原性,因此Ⅳ类蛋白不应该包含在疫苗成分中,在分离的OMP中尽量减少这种蛋白很重要:V类蛋白在细菌粘附和入侵宿主细胞上起到很大的作用,也是正在被研究的疫苗候选物。

实验挑选了3株具有代表性的菌株,使用去垢剂提取了它们的外膜蛋白（OMPs）,SDS-PAGE分析发现:3株菌的OMPs带谱不完全相同,但都含有Ⅰ、Ⅱ/Ⅲ、Ⅳ和V类外膜蛋白。以29356菌株蛋白复合物的不同剂量和针次免疫NIH小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清IgG抗体滴度,结果显示:不同剂量免疫均能诱导小鼠产生IgG抗体,其效价可达1:128000,说明其免疫原性良好。经实验比较选择免疫方案免疫小鼠,然后用3株脑膜炎球菌菌株进行腹腔攻毒,观察主动免疫和交叉免疫保护效果。

结果显示:以10个LD50的活菌攻击免疫小鼠后,29356菌株组存活率为100%,51169菌株组存活率是0%,29004菌株组存活率是0%,而阴性对照组存活率为0%,表明以该蛋白复合物免疫小鼠后对同血清型菌的攻毒有很好保护力,但是,对B群的其他菌株缺乏交叉保护。

参考文献

[1]Detection of LP2086 on the cell surface of Neisseria meningitidis and its accessibility in the presence of serogroup B capsular polysaccharide[J].Lisa K.McNeil,Ellen Murphy,Xiao-Juan Zhao,Stephen Guttmann,Shannon L.Harris,Adrienne A.Scott,Cuiwen Tan,Michelle Mack,Ida DaSilva,Kristin Alexander,Kathryn Mason,Han-Qing Jiang,Duzhang Zhu,Terri L.Mininni,Gary W.Zlotnick,Susan K.Hoiseth,Thomas R.Jones,Michael W.Pride,Kathrin U.Jansen,Annaliesa S.Anderson.Vaccine.2009(25)

[2]MeNZB?vaccine and epidemic control:When do you stop vaccinating?[J].Belinda J.Loring,Nikki Turner,Helen Petousis-Harris.Vaccine.2008(47)

[3]An effective serogroup B meningococcal vaccine[J].Francisco Domínguez,Jorge Menéndez,Rolando Ochoa.Vaccine.2006(49)

[4]New Zealand’s epidemic of meningococcal disease described using molecular analysis:implications for vaccine delivery[J].K.Dyet,A.Devoy,R.McDowell,D.Martin.Vaccine.2005(17)

[5]时宇.B群脑膜炎球菌外膜蛋白复合物免疫原性初探[D].北京生物制品研究所,2009.