人B细胞受体(BCR)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人B细胞受体(BCR)ELISA试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本人B细胞受体(BCR)含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被B细胞受体(BCR)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的B细胞受体(BCR)）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人B细胞受体(BCR)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

应用^[4][5]

用于膀胱癌B细胞抗原受体（BCR）H链CDR3多样性分析研究

探讨膀胱癌患者的B淋巴细胞免疫图谱的多样性,客观准确地评估膀胱癌的免疫状态,阐明膀胱癌的病因学及发病机制,为疾病诊断、治疗和预后监测提供新的理论依据。

方法:收集5例手术切除新鲜冻存的膀胱癌组织（癌组织组）及其癌旁组织（对照组）,分别从各组织中提取全基因组DNA。通过设计各V区家族和J区家族引物,扩增出BCR的所有CDR3区,再结合新一代高通量测序技术和平台,分析癌组织组和对照组中B细胞BCR H链CDR3区多样性、长度分布特征及各基因家族的表达频率等;比较CDR3氨基酸序列长度分布的正态性,V区、D区、J区和V-J组合区基因使用频率分布,个体TOP 20 V基因使用情况;从海量数据中筛选癌组织组和对照组中高度克隆性扩增的DNA序列（频率大于0.5%）、氨基酸序列（频率大于0.5%）、V-J组合（频率大于1%）,及独有/共有DNA序列、氨基酸序列和V-J组合;此外,根据香农熵分析癌组织组与对照组中的BCR多样性差异和克隆表达差异。揭示膀胱癌组织和癌旁组织中B淋巴细胞的免疫特性,阐明膀胱癌病理生理机制并寻找新的生物标志物、免疫治疗靶点。

结果:1.长度分布频率:癌组织组中BCR H链CDR3氨基酸序列的长度分布频率的5个为17,16,19,15和11 nt,对照组中5个为15,17,16,14和18nt;癌组织组和对照组的高斯分布拟合值分别为0.70和0.96。表明对照组的CDR3氨基酸序列长度分布比癌组织组更趋向于正态分布。

2. 克隆性扩增程度:与对照组相比,癌组织组B细胞高度克隆性扩增（频率大于0.5%）的DNA序列、氨基酸序列增加,且总体克隆性扩增程度增加。

3.BCR多样性:通过计算癌组织组的香农熵系数为0.39和对照组的香农熵系数为0.59,发现癌组织组的免疫组库多样性低于对照组。

4.高度克隆性扩增（HEC）序列:统计分析后筛选发现癌组织组的高度扩增性克隆数为41个,高克隆比率为72%;对照组的高度扩增性克隆数为12个,高克隆比率为14%。结果表明无论在高度扩增性克隆数上,还是在高克隆比率上,癌组织组都是显著高于对照组。5.癌组织组和对照组间的IGHV、IGHD和IGH J及V-J组合的表达频率存在明显差异。

参考文献

[1]Survival of the fittest:Cancer challenges T cell metabolism[J].Davide G.Franchina,Feng He,Dirk Brenner.Cancer Letters.2018

[2]T Cells and Cancer:How Metabolism Shapes Immunity.[J].Molon Barbara,CalìBianca,Viola Antonella.Frontiers in immunology.2016

[3]The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism[J].Natalya N.Pavlova,Craig B.Thompson.Cell Metabolism.2016(1)

[4]Phenotypic and functional characteristics of CD39＜sup＞high＜/sup＞human regulatory B cells（Breg）.[J].FigueiróF,Muller L,Funk S,Jackson E K,Battastini A M O,Whiteside T L.Oncoimmunology.2016(2)

[5]侯姝芳.膀胱癌B细胞抗原受体（BCR）H链CDR3多样性分析[D].广西师范大学,2018.