小鼠丙酮酸激酶M2型同工酶(M2-PK)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

小鼠丙酮酸激酶M2型同工酶(M2-PK)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中小鼠丙酮酸激酶M2型同工酶（M2-PK）的含量。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被小鼠丙酮酸激酶M2型同工酶（M2-PK）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠丙酮酸激酶M2型同工酶（M2-PK）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

小鼠丙酮酸激酶M2型同工酶(M2-PK)ELISA试剂盒

样本处理及要求

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于长非编码RNA HULC通过LDHA和PKM2促进肝癌细胞有氧糖酵解研究

通过托普霉素（tobramycin）亲和纯化的方法结合定量质谱分析的检测方法,以高效筛选细胞内的lnc RNA相互作用蛋白。

利用该方法发现140个潜在的lnc RNA HULC（highly-upregulated in liver cancer）相互作用蛋白,并构建了HULC与蛋白质相互作用网络。这些相互作用蛋白根据生物功能可以分为7群,包括代谢、细胞黏附、病毒应答、RNA进程、囊泡运输、转录调控和DNA修复,揭示了HULC在不同生物进程中的潜在作用。质谱结果显示HULC可能与一些糖酵解通路的酶有相互作用,包括乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A,LDHA）和丙酮酸激酶同工酶M2（pyruvate kinase M2,PKM2）,这提示HULC可能参与调控糖代谢。LDHA和PKM2在肿瘤细胞有氧糖酵解中发挥重要作用。

接下来,利用体外RNA pull-down、RNA免疫共沉淀（RIP）、电泳迁移率变动分析（EMSA）等方法验证HULC与LDHA、PKM2有直接的结合,并利用Biacore系统测定HULC与LDHA结合的平衡解离常数KD为2.898×10-8 M,HULC与PKM2结合的平衡解离常数KD为2.045×10-7 M。

同时还发现HULC影响乳酸脱氢酶和丙酮酸激酶的酶活性,并且LDHA和PKM2的磷酸化水平与细胞中HULC表达量有关。进一步阐释HULC调控LDHA和PKM2的分子机制,我们发现成纤维细胞生长因子受体1型（FGFR1）影响LDHA、PKM2的磷酸化,RIP结果显示FGFR1与HULC结合,并且FGFR1抑制剂PD166866能抑制HULC过表达引起的LDHA和PKM2的磷酸化水平的升高。

通过体外纯化的RNA pull-down、his-tag pull-down、RNA FISH结合免疫荧光、膜蛋白提取等方法分析FGFR1、HULC、LDHA和PKM2的膜定位,发现HULC可能作为一个衔接分子,促进FGFR1与LDHA、PKM2的结合,进而使FGFR1作用的LDHA和PKM2的磷酸化水平升高。

生化实验结果显示HULC影响肝癌细胞的葡萄糖摄取、乳酸生成、氧消耗率（OCR）、胞外酸化率（ECAR）、Acetyl-Co A的浓度等,说明HULC调控肝癌细胞糖酵解和氧化磷酸化进程。在细胞水平我们通过CCK-8、生长曲线实验研究HULC对肝癌细胞增殖能力的影响。同时我们分别利用糖酵解抑制剂2-DG和ATP合成酶抑制剂oligomycin干扰细胞的两种不同的能量代谢状态,并对比HULC不同表达量的细胞增殖情况,从而研究HULC如何通过糖酵解调控肝癌细胞的增殖。

实验结果显示2-DG和oligomycin均抑制肝癌细胞的增殖,但HULC表达量高的细胞对糖酵解抑制剂2-DG更敏感,而HULC表达量低的细胞对ATP合成酶抑制剂oligomycin更敏感,说明HULC可能通过平衡糖酵解和氧化磷酸化的水平来调控肝癌细胞的增殖。小鼠实验显示HULC过表达促进体内肝癌细胞的生长并促进乳酸的生成。

参考文献

[1]LncRNA LINRIS stabilizes IGF2BP2 and promotes the aerobic glycolysis in colorectal cancer.[J].Wang Yun,Lu Jia-Huan,Wu Qi-Nian,Jin Ying,Wang De-Shen,Chen Yan-Xing,Liu Jia,Luo Xiao-Jing,Meng Qi,Pu Heng-Ying,Wang Ying-Nan,Hu Pei-Shan,Liu Ze-Xian,Zeng Zhao-Lei,Zhao Qi,Deng Rong,Zhu Xiao-Feng,Ju Huai-Qiang,Xu Rui-Hua.Molecular cancer.2019(1)

[2]Aberrant FGFR Tyrosine Kinase Signaling Enhances the Warburg Effect by Reprogramming LDH Isoform Expression and Activity in Prostate Cancer.[J].Liu Junchen,Chen Guo,Liu Zezhen,Liu Shaoyou,Cai Zhiduan,You Pan,Ke Yuepeng,Lai Li,Huang Yun,Gao Hongchang,Zhao Liangcai,Pelicano Helene,Huang Peng,McKeehan Wallace L,Wu Chin-Lee,Wang Cong,Zhong Weide,Wang Fen.Cancer research.2018(16)

[3]Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs[J].Florian Kopp,Joshua T.Mendell.Cell.2018(3)

[4]A genetic variant in long non-coding RNA HULC contributes to risk of HBV-related hepatocellular carcinoma in a Chinese population.[J].Yao Liu,Shandong Pan,Li Liu,Xiangjun Zhai,Jibin Liu,Juan Wen,Yixin Zhang,Jianguo Chen,Hongbing Shen,Zhibin Hu.PLoS ONE.2017(4)

[5]王春晴.长非编码RNA HULC通过LDHA和PKM2促进肝癌细胞有氧糖酵解[D].天津医科大学,2020.