人抗中性粒细胞抗体(ANA)ELISA 试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗中性粒细胞抗体(ANA)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人抗中性粒细胞抗体（ANA）的含量。

实验原理

人抗中性粒细胞抗体(ANA)ELISA试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人抗中性粒细胞抗体（ANA）捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗中性粒细胞抗体（ANA）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人抗中性粒细胞抗体(ANA)ELISA试剂盒

样品收集、处理及保存方法：

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：edta、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

[实验结果计算]

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于抗中性粒细胞胞浆抗体与炎症性肠病关联性探讨研究

针对出现消化道病症且ANCA阳性人群的分布状况及临床特征探讨分析,旨在揭示ANCA对IBD的早期预警价值。

方法:收集整理2019年1月至2021年12月于消化科就诊且行ANCA检测的患者病历资料2795例,检测结果阳性者设为ANCA阳性组,参照阳性组的性别年龄构成比在同期健康体检人群中分层抽样568例进行ANCA检测设为健康对照组,并与消化科就诊人群进行对比;就诊人群中ANCA检测结果阴性者全部纳入阴性对照组,分析ANCA阳性组的临床特征及分布特征,并与阴性对照组进行对比分析;计数资料用率或百分比表示,组间率的比较采用χ~2检验,以P＜0.01为差异有显著性统计学意义。

结果:1.消化科三年共检测ANCA 2795例,其中ANCA阳性442例,阳性检出率为15.81%（442/2795）,明显高于健康对照组的阳性检出率3.17%（18/568）,χ~2=63.927,P＜0.01,差异有显著性统计学意义。

2.442例ANCA阳性组中,核周型ANCA（perinuclear ANCA,p ANCA）289例,占65.38%（289/442）,胞浆型ANCA（cytoplasmic ANCA,c ANCA）153例,占34.62%（153/442）,p ANCA阳性率显著高于c ANCA,χ~2=83.692,P＜0.01,差异有显著性统计学意义。

3.442例ANCA阳性组临床症状中腹痛伴黏液脓血便、腹痛伴腹胀、腹泻、恶心伴呕吐的发生率较高,分别为23.53%（104/442）、21.49%（95/442）、13.35%（59/442）、7.24%（32/442）,其中腹痛伴黏液脓血便、腹痛伴腹胀、腹泻的发生率明显高于阴性对照组的2.17%（51/2353）、7.86%（185/2353）、6.93%（163/2353）,差异有统计学意义。

4.ANCA阳性组中有257例行肠镜及病理检查,经临床综合评判符合IBD诊断的有136例,占比52.92%（136/257）;ANCA阴性组中有716例行肠镜及病理检查,经临床综合评判符合IBD诊断的有49例,占比6.84%（49/716）,ANCA阳性组IBD确诊率显著高于阴性对照组,χ~2=260.727,P＜0.01,差异有显著性统计学意义。结论:消化科就诊人群ANCA阳性率显著高于健康体检人群,以p ANCA为主,且ANCA阳性人群IBD确诊率显著高于阴性人群。ANCA对IBD有预警价值,对出现消化道症状尤其是腹痛伴黏液脓血便、腹痛伴腹胀、腹泻的人群及早检测ANCA有利于IBD的早期发现。

参考文献

[1]Antibody subtypes and titers predict clinical outcomes in ANCA-associated vasculitis[J].Muhammad Aljuhani,Devan Makati,Abigail Hoff,Jesse Thompson,Bethany Pellegrino,Khaled Shawwa,Rebecca Schmidt,Dinesh Kannabhiran.Rheumatology International.2021(5)

[2]Assessment of clinical activity and severity using serum ANCA and ASCA antibodies in patients with ulcerative colitis[J].Pang Yanhua,Ruan Huijie,Wu Dongfang,Lang Yanfei,Sun Ke,Xu Cuiping.Allergy,Asthma＆Clinical Immunology.2020(1)

[3]Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies（ANCA）:Antigen interactions and downstream effects.[J].Sundqvist Martina,Gibson Kristen M,Bowers Sarah M,Niemietz Iwona,Brown Kelly L.Journal of leukocyte biology.2020(2)

[4]The diagnostic role and clinical association of serum proteinase 3 anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in Chinese patients with inflammatory bowel disease.[J].Xu Yan,Xu Fei,Li Wenjie,Li Mengting,Dong Shouquan,Zhang Yupeng,Norman Gary L,Zhao Qiu,Liu Lan.Scandinavian journal of gastroenterology.2020(7)

[5]牛颖颖.抗中性粒细胞胞浆抗体与炎症性肠病关联性探讨[D].承德医学院,2022.