人抗脱氧核糖核蛋白抗体(DNP-AB)ELISA试剂盒的应用

背景^[1-3]

人抗脱氧核糖核蛋白抗体(DNP-AB)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中抗脱氧核糖核蛋白抗体(DNP-AB)的含量。

实验原理

人抗脱氧核糖核蛋白抗体(DNP-Ab)ELISA试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人抗脱氧核糖核蛋白抗体(DNP-Ab)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗脱氧核糖核蛋白抗体(DNP-Ab)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人抗脱氧核糖核蛋白抗体(DNP-Ab)ELISA试剂盒

样本处理要求

1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于SmD1蛋白表达与免疫原性研究及其抗体检测初步应用研究

采用基因工程技术,获取原核表达和真核表达的SmmDl重组蛋白,观察两者免疫原性和抗原性的差异。探索SmD1蛋白在免疫过量的情况下,诱导抗dsDNA抗体和其它抗核抗体产生的可能性,为寻找系统性红斑狼疮的启动原及发病机理提供实验依据；最后,以昆虫细胞表达的SmD1蛋白为抗原,研制抗SmD1抗体测定酶联免疫试剂,并进行初步的应用评价。

方法：以化学合成方法获得目的基因,经PCR扩增,测序正确后,分别克隆到原核表达载体pET-21a和真核表达载体pFastBacTM1上,成功构建了重组质粒pET-21a-SmD1和pFastBacTM1-SmD1。

（1）原核表达：将质粒pET-21a-SmD1转化到大肠杆菌BL21,选取阳性克隆,16℃低温条件下,1mmol IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白,Ni-NTA亲和层析柱纯化。

（2）真核表达：将质粒pFastBacTM1-SmD1转化到DH10Bac,蓝白斑筛选阳性克隆,获得重组穿梭载体Bacmid,转染昆虫细胞Sf9,接着进行重组杆状病毒的扩增,目的蛋白表达,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白,Ni-NTA亲和层析柱纯化,Western blot验证。

（3）免疫原性研究：将原核表达蛋白和真核表达蛋白以皮下多点注射方式免疫4周龄Balb/c雌鼠,每隔两周免疫一次,共免疫三次,在第0周、2周、5周和9周,取小鼠血清,ELISA检测抗dsDNA抗体IgG,LIA法检测ANA谱,第9周处死,取脾脏T淋巴细胞,ELISPOT检测分泌IFN-y T淋巴细胞的频数,流式细胞术检测脾T淋巴细胞亚群CD3、CD4和CD8的比例及CD3+CD4+/CD4+CD8+的比值。

（4）建立检测抗SmD1抗体的间接ELISA方法,检测553例各类型自身免疫性疾病患者血清,其中230例SLE。

结果：经DNA序列分析和双酶切鉴定证实了重组质粒pET-21a-SmD1和pFastBacl-SmD1构建正确,并且分别在大肠杆菌BL21和杆状病毒／昆虫细胞系统（AcMNPV/Sf9）表达成功,获得目的蛋白。经Ni-NTA亲和层析柱高效分离带HIS标签的重组蛋白SmD1,纯度大于95%。经Bradford法测定,大肠杆菌表达的重组蛋白浓度为0.62mg/mL,昆虫细胞表达的重组蛋白浓度为0.908mg/mL。免疫原性研究发现,同时期,昆虫细胞Sf9表达的SmD1蛋白诱导抗Sm抗体和抗dsDNA抗体滴度比大肠杆菌BL21表达的蛋白诱导的抗体滴度高。

Sf9表达的SmD1蛋白诱导抗dsDNA抗体滴度于第二次免疫后1周（第5周）达到顶峰,之后逐渐下降,而BL21表达的SmD1蛋白诱导的抗dsDNA抗体滴度在9周之内,滴度随时间的延长不断增加。抗dsDNA抗体在各组中的差异均有统计学意义。同时,SmD1重组蛋白也会诱导IgG抗SSA/60抗体、抗SSA/52抗体、抗SSB抗体、抗Scl-70抗体和抗U1-snRNP抗体的产生。在SmDl免疫过量的情况下,原核蛋白免疫组、真核蛋白免疫组的CD4+/CD8+平衡失调,与对照组比较,CD3+CD4+值下降,CD3+CD8+值升高,CD3+CD4+/CD3+CD8+比值下降。

参考文献

[1]Several Affinity Tags Commonly Used in Chromatographic Purification[J].Xinyu Zhao,Guoshun Li,Shufang Liang,Kiran Kumar Doddapaneni.Journal of Analytical Methods in Chemistry.2013

[2]The Role of Microparticles in the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus[J].J.R.Dye,A.J.Ullal,D.S.Pisetsky.Scand J Immunol.2013(2)

[3]Systemic lupus erythematosus and infections:Clinical importance of conventional and upcoming biomarkers[J].S.Sciascia,L.Ceberio,C.Garcia-Fernandez,D.Roccatello,Y.Karim,M.J.Cuadrado.Autoimmunity Reviews.2012(2)

[4]Systemic lupus erythematosus associated with ANCA-associated vasculitis:an overlapping syndrome?[J].B.Hervier,M.Hamidou,J.Haroche,C.Durant,A.Mathian,Z.Amoura.Rheumatology International.2012(10)

[5]钟运华.SmD1蛋白表达与免疫原性研究及其抗体检测初步应用[D].广州中医药大学,2014.