人表皮生长因子(EGF)ELISA 试剂盒的应用

背景[1-3]

人表皮生长因子(EGF)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中表皮生长因子(EGF)的含量。

实验原理

人表皮生长因子(EGF)ELISA试剂盒采用间接法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被表皮生长因子(EGF)捕获抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的表皮生长因子(EGF)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

人表皮生长因子(EGF)ELISA试剂盒

样品收集、处理及保存方法：

1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：edta、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

操作步骤

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

[实验结果计算]

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

应用^[4][5]

用于人表皮生长因子在毕赤酵母中分泌表达的研究

通过优化信号肽序列及基因剂量,共表达分子伴侣PDI与转录因子Aft1、Hac1p,以期提高人表皮生长因子在毕赤酵母中的分泌表达水平,得到高效表达人表皮生长因子的毕赤酵母基因工程菌株。

（1）根据巴斯德毕赤酵母密码子偏好性,优化信号肽并将优化的序列Nα插入p PICZαA中,获得重组载体p PICZ-Nα。以p PICZ-Nα和p PICZα-rhEGF为模板,获得片段Nα和rhEGF。通过SOE-PCR构建重组片段Nα-rhEGF,并插入p PICZαA中获得p PICZ-Nα-rhEGF。将重组载体转移至巴斯德毕赤酵母KM71基因组中,得到表达菌株KM71-p PICZ-α-rhEGF和KM71-p PICZ-Nα-rhEGF。菌株KM71-p PICZ-α-rhEGF、KM71-p PICZ-Nα-rhEGF经摇瓶诱导发酵96h,取上清进行检测,结果表明KM71-p PICZ-α-rhEGF胞外分泌总蛋白、活性分别达到93.2675±13.4678 mg/L、96065±5609 IU/m L,KM71-p PICZ-Nα-rh EG F胞外分泌总蛋白、活性分别达到134.5165±17.7482 mg/L、141242±18128 IU/m L,相比菌株KM71-p PICZ-α-rhEGF分别提高了44.22%和47.02%。

（2）利用内切酶BglⅡ和Bam HⅠ互为同尾酶,以p PICZ-Nα-rhEGF为基础,分别构建含2、3、4、5拷贝数人表皮生长因子表达框的重组质粒p PICZ-2Nα-rhEGF、p PICZ-3Nα-rhEGF、p PICZ-4Nα-rhEGF、p PICZ-5Nα-rhEGF,并连接His4片段。将线性化后的重组质粒p PICZ-2Nα-rhEGF-His4、p PICZ-3Nα-rhEGF-His4、p PICZ-3Nα-rhEGF-His4和p PICZ-5Nα-rhEGF-His4电转化至毕赤酵母KM71菌株,在含Zeocin抗生素（100μg/m L）的YPDS平板进行筛选,重组子用荧光定量PCR进行鉴定,得到分别含2、3、4、5拷贝人表皮生长因子表达框的毕赤酵母重组菌株表达菌株KM71-p PICZ-2Nα-rhEGF-His4、K M71-p PICZ-3Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-5Nα-rhEGF-His4。将含1、2、3、4、5拷贝人表皮生长因子表达框的重组菌株经摇瓶诱导发酵96 h,取发酵上清液进行检测。菌株KM71-p PICZ-Nα-rhEGF、KM71-p PIC Z-2Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-3Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4、KM71-p PICZ-5Nα-rhEGF-His4胞外分泌总蛋白产量分别为134.5165±17.7482 mg/L;143.9850±17.862 mg/L、169.6153±17.6628 mg/L、237.6390±23.6773 mg/L、127.3843±15.6234 mg/L,发酵液上清总活性分别为137040±25124IU/m L、153344±23105 IU/m L、175551±19862 IU/m L、235052±23398 IU/m L和1118467±24170 IU/m L。四拷贝菌株KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4胞外蛋白总量与活性最高,较一拷贝表达菌株KM71-p PICZ-Nα-rhEGF,其胞外蛋白含量和最终胞外蛋白含量分别提高了81.73%和71.52%。菌株KM71-p PICZ-5Nα-rhEGF-His4分别仅为四拷贝菌株的53.60%和50.40%。

（3）提取菌株DH5α-p PICZ9K-PDI-G418、DH5α-p PICZ9K-Aft1-G418和DH5α-p PICZ9K-Hac1p-G418质粒后使用电转法,得到共表达菌株KM71-p PIC Z-4Nα-rhEGF-His4-PDI、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-Aft1和KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-Hac1p。共表达菌株KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-PDI、KM71-p PICZ-4Nα-rh EG F-His4-Aft1、KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4-Hac1p经小批量发酵96h后检测发酵液中胞外分泌总蛋白含量分别为227.4239±20.1687 mg/L、144.5416±20.0676 mg/L、171.006±24.3572 mg/L、309.0315±25.4678 mg/L;总活性分别为218554±27542 IU/m L、145987±24268 IU/m L、176136±25087 IU/m L、311812±22697 IU/m L。其中,共表达分子伴侣PDI与转录因子Aft1对分泌目标蛋白产生负面影响,共表达转录因子Hac1p对菌株分泌目标蛋白具有显著促进作用,相较于四拷贝菌株KM71-p PICZ-4Nα-rhEGF-His4胞外蛋白含量和活性分别提升了35.88%和36.68%。

参考文献

[1]Heterologous Protein Expression in Pichia pastoris:Latest Research Progress and Applications.[J].Juturu Veeresh,Wu Jin Chuan.Chembiochem:a European journal of chemical biology.2018(1)

[2]Effect of cooperation of chaperones and gene dosage on the expression of porcine PGLYRP-1 in Pichia pastoris.[J].Yang Jun,Lu Zhipeng,Chen Jiawei,Chu Pinpin,Cheng Qingmei,Liu Jie,Ming Feiping,Huang Chaoyuan,Xiao Anji,Cai Haiming,Zhang Linghua.Applied microbiology and biotechnology.2016(12)

[3]Pichia pastoris Aft1--a novel transcription factor,enhancing recombinant protein secretion.[J].Ruth Claudia,Buchetics Markus,Vidimce Viktorija,Kotz Daniela,Naschberger Stefan,Mattanovich Diethard,Pichler Harald,Gasser Brigitte.Microbial cell factories.2014(1)

[4]Protein expression in Pichia pastoris:recent achievements and perspectives for heterologous protein production.[J].Ahmad Mudassar,Hirz Melanie,Pichler Harald,Schwab Helmut.Applied microbiology and biotechnology.2014(12)

[5]王儒昕.人表皮生长因子在毕赤酵母中分泌表达的研究[D].武汉轻工大学,2020.